小鼠胚胎干細胞分化為肝祖細胞的研究及機制探討.pdf

1、我國為病毒性肝炎的高發(fā)區(qū),由病毒性肝炎導(dǎo)致的重型肝炎死亡率可達50％-70％。目前對于重癥肝功能衰竭的患者的治療方案主要為整體肝臟移植,但是供體肝的來源有限,使得許多需要肝移植的患者得不到及時救治。肝細胞移植是治療終末期肝病較有希望的技術(shù)之一。1988年Bumgardner等率先提出了肝細胞移植概念,直至1993年,才由Mito等開展了世界首例人體肝細胞移植技術(shù)(自體同源性肝細胞移植),隨后肝細胞移植技術(shù)的研究工作快速發(fā)展,并成為生物醫(yī)

2、學(xué)研究的熱點領(lǐng)域之一,而肝細胞移植研究的關(guān)鍵是肝細胞的來源問題。臨床研究表明,自體成熟的肝細胞最適合臨床移植。然而,應(yīng)用自體成熟肝細胞的主要限制因素是病狀情況下肝臟不能產(chǎn)生大量的正常肝功能細胞,也不能保持肝細胞補充的恒定需要,因此,人們首先想到了胚胎干細胞。 ES細胞具有自我更新、多向分化、無限增殖等全能干細胞特性,可能是解決這一難題的希望所在,它可以通過細胞分裂維持自身細胞群體的大小,同時又可以進一步分化成為不同組織的細胞。所

3、以,ES細胞有望成為人工肝臟和肝細胞移植治療的種子細胞新來源,從而應(yīng)用于組織構(gòu)建和細胞治療當(dāng)中,如果這些肝細胞移植手段已經(jīng)技術(shù)成熟,并細胞來源充足的話,會使生物工程中的肝細胞移植治療和人工肝組織器官移植有可能成為21世紀(jì)人類攻克肝臟疾病的根本治療措施。 2002年,Chinzei實驗室利用ES細胞可以自發(fā)分化形成擬胚體這一方法,分化得到類肝細胞,并將分化的細胞移植于肝損傷小鼠中,4周后發(fā)現(xiàn)分化的細胞可以整合入受體肝臟中。同年,Y

4、amada等也報道了相似的研究成果。在隨后幾年中,胚胎干細胞向肝細胞分化的研究迅速發(fā)展,模擬體內(nèi)胚胎肝臟發(fā)育的過程和機制,在誘導(dǎo)分化的過程中,分步驟加入了生長因子等誘導(dǎo)劑,以期得到高效率的肝細胞。而且,這種分化ES細胞為肝細胞的探索也為胎肝發(fā)生及形成的機制研究提供一個很好的體外研究平臺。 本研究采用小鼠胚胎干細胞E14.1細胞系,利用無滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng),將帶有抗性基因篩選的質(zhì)粒:Alb啟動子調(diào)控的紅色熒光蛋白(mRFP),

5、CK19啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白(EGFP)同時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES細胞,建立遺傳修飾ES細胞系E14.1-1;Alb啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白(EGFP),CK19啟動子調(diào)控的hCD25和紅色熒光蛋白(tdTOMATO)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES細胞,建立E14.1-2細胞系。在體外,對E14.1-1和E14.1-2細胞系同時進行了傳統(tǒng)血清和無血清的誘導(dǎo)方法,比較兩種方法產(chǎn)生內(nèi)胚層細胞和肝祖細胞的區(qū)別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在血清誘導(dǎo)中,內(nèi)胚層細胞和肝祖細胞的產(chǎn)生率很低,

6、分別為14％和3％。 在無血清培養(yǎng)條件下,采用兩步誘導(dǎo)法分化產(chǎn)生肝祖細胞。遺傳修飾后的胚胎干細胞E14.1-1和E14.1-2,首先懸浮培養(yǎng)形成EB,生長2天后,加入activin A繼續(xù)誘導(dǎo)分化2天,根據(jù)定形內(nèi)胚層(definitive endoderm,DE)細胞膜表面標(biāo)志抗原為CXCR4、ECD、c-Kic,通過FACS分析,無論是CXCR4+/ECD+還是CXCR4+/c-Kit+細胞群,在誘導(dǎo)分化的第4天達到峰值75‰

7、誘導(dǎo)后內(nèi)胚層基因Foxa2、Sox17、Hex、Shh、Gata4、Gata6都開始表達,中胚層基因Flk1、Mixl1也有表達,但是沒有檢測到神經(jīng)外胚層基因Pax6的表達；分選CXCR4+/c-Kit+細胞群,內(nèi)胚層基因Foxa2、Sox17、Hex都在CXCR4+/c-Kit+細胞群內(nèi)表達,而且不表達臟壁內(nèi)胚層(visceral endoderm,VE)的基因Sox7,說明通過此方法誘導(dǎo)后,分選得到的CXCR4+/c-Kit+細胞群

8、為定形內(nèi)胚層細胞。 分選定形內(nèi)胚層細胞,比較懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)對肝祖細胞分化的影響。懸浮培養(yǎng)：將細胞懸浮培養(yǎng)在低貼附培養(yǎng)皿中,令其形成球狀克隆,培養(yǎng)基中加入bFGF、BMP-4生長因子,誘導(dǎo)48小時后,可明顯檢測到有關(guān)肝分化的基因(Proxl、Afp、Hnf4、Ttr)上調(diào),將球狀克隆貼附于I型膠原上,加入HGF、EGF繼續(xù)培養(yǎng)；單層貼壁培養(yǎng)：將細胞貼于鋪有I型膠原的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)基與單層培養(yǎng)方法一致；在培養(yǎng)12天時,可

9、在球狀克隆中檢測到ALB和CK19雙陽性的細胞,FACS分析ALB+/CK19+細胞比例為22％,而單層培養(yǎng)中并未看到ALB和CK19的表達。RT-PCR檢測表明,球狀克隆生長的內(nèi)胚層細胞分化程度要早于單層貼壁培養(yǎng)的內(nèi)胚層細胞。 利用體外ES細胞經(jīng)內(nèi)胚層分化為肝祖細胞的發(fā)育模式,研究Gata4和Gata6在肝臟形成中的作用。采用RNA干擾的方法,建立穩(wěn)定RNAi的ES細胞系,通過Q-PCR檢測到,在向內(nèi)胚層分化過程中,Gata4

10、和Gata6并沒有影響到DE基因Tm4sf2和Cxcr4的表達,然而卻影響到了VE基因Emp2和Amn的表達；同時抑制Gata4和Gata6表達后,肝祖細胞發(fā)育相關(guān)的基因Afp、Hnf4、Ttr的表達均被降低,但單獨抑制一個因子則沒有很明顯的變化,說明在肝祖細胞分化過程中,Gata4和Gata6起到重要作用,并在功能上相互補償。 本實驗研究首次遵循胚胎肝臟發(fā)育過程,采用從胚胎干細胞經(jīng)內(nèi)胚層分化為肝祖細胞的方法,明確地產(chǎn)生同一發(fā)育