小鼠胚胎干細(xì)胞分化為肝祖細(xì)胞的研究及機(jī)制探討.pdf

1、我國為病毒性肝炎的高發(fā)區(qū),由病毒性肝炎導(dǎo)致的重型肝炎死亡率可達(dá)50％-70％。目前對于重癥肝功能衰竭的患者的治療方案主要為整體肝臟移植,但是供體肝的來源有限,使得許多需要肝移植的患者得不到及時救治。肝細(xì)胞移植是治療終末期肝病較有希望的技術(shù)之一。1988年Bumgardner等率先提出了肝細(xì)胞移植概念,直至1993年,才由Mito等開展了世界首例人體肝細(xì)胞移植技術(shù)(自體同源性肝細(xì)胞移植),隨后肝細(xì)胞移植技術(shù)的研究工作快速發(fā)展,并成為生物醫(yī)

2、學(xué)研究的熱點領(lǐng)域之一,而肝細(xì)胞移植研究的關(guān)鍵是肝細(xì)胞的來源問題。臨床研究表明,自體成熟的肝細(xì)胞最適合臨床移植。然而,應(yīng)用自體成熟肝細(xì)胞的主要限制因素是病狀情況下肝臟不能產(chǎn)生大量的正常肝功能細(xì)胞,也不能保持肝細(xì)胞補(bǔ)充的恒定需要,因此,人們首先想到了胚胎干細(xì)胞。 ES細(xì)胞具有自我更新、多向分化、無限增殖等全能干細(xì)胞特性,可能是解決這一難題的希望所在,它可以通過細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群體的大小,同時又可以進(jìn)一步分化成為不同組織的細(xì)胞。所

3、以,ES細(xì)胞有望成為人工肝臟和肝細(xì)胞移植治療的種子細(xì)胞新來源,從而應(yīng)用于組織構(gòu)建和細(xì)胞治療當(dāng)中,如果這些肝細(xì)胞移植手段已經(jīng)技術(shù)成熟,并細(xì)胞來源充足的話,會使生物工程中的肝細(xì)胞移植治療和人工肝組織器官移植有可能成為21世紀(jì)人類攻克肝臟疾病的根本治療措施。 2002年,Chinzei實驗室利用ES細(xì)胞可以自發(fā)分化形成擬胚體這一方法,分化得到類肝細(xì)胞,并將分化的細(xì)胞移植于肝損傷小鼠中,4周后發(fā)現(xiàn)分化的細(xì)胞可以整合入受體肝臟中。同年,Y

4、amada等也報道了相似的研究成果。在隨后幾年中,胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的研究迅速發(fā)展,模擬體內(nèi)胚胎肝臟發(fā)育的過程和機(jī)制,在誘導(dǎo)分化的過程中,分步驟加入了生長因子等誘導(dǎo)劑,以期得到高效率的肝細(xì)胞。而且,這種分化ES細(xì)胞為肝細(xì)胞的探索也為胎肝發(fā)生及形成的機(jī)制研究提供一個很好的體外研究平臺。 本研究采用小鼠胚胎干細(xì)胞E14.1細(xì)胞系,利用無滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng),將帶有抗性基因篩選的質(zhì)粒:Alb啟動子調(diào)控的紅色熒光蛋白(mRFP),

5、CK19啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白(EGFP)同時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞,建立遺傳修飾ES細(xì)胞系E14.1-1;Alb啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白(EGFP),CK19啟動子調(diào)控的hCD25和紅色熒光蛋白(tdTOMATO)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞,建立E14.1-2細(xì)胞系。在體外,對E14.1-1和E14.1-2細(xì)胞系同時進(jìn)行了傳統(tǒng)血清和無血清的誘導(dǎo)方法,比較兩種方法產(chǎn)生內(nèi)胚層細(xì)胞和肝祖細(xì)胞的區(qū)別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在血清誘導(dǎo)中,內(nèi)胚層細(xì)胞和肝祖細(xì)胞的產(chǎn)生率很低,

6、分別為14％和3％。 在無血清培養(yǎng)條件下,采用兩步誘導(dǎo)法分化產(chǎn)生肝祖細(xì)胞。遺傳修飾后的胚胎干細(xì)胞E14.1-1和E14.1-2,首先懸浮培養(yǎng)形成EB,生長2天后,加入activin A繼續(xù)誘導(dǎo)分化2天,根據(jù)定形內(nèi)胚層(definitive endoderm,DE)細(xì)胞膜表面標(biāo)志抗原為CXCR4、ECD、c-Kic,通過FACS分析,無論是CXCR4+/ECD+還是CXCR4+/c-Kit+細(xì)胞群,在誘導(dǎo)分化的第4天達(dá)到峰值75‰

7、誘導(dǎo)后內(nèi)胚層基因Foxa2、Sox17、Hex、Shh、Gata4、Gata6都開始表達(dá),中胚層基因Flk1、Mixl1也有表達(dá),但是沒有檢測到神經(jīng)外胚層基因Pax6的表達(dá)；分選CXCR4+/c-Kit+細(xì)胞群,內(nèi)胚層基因Foxa2、Sox17、Hex都在CXCR4+/c-Kit+細(xì)胞群內(nèi)表達(dá),而且不表達(dá)臟壁內(nèi)胚層(visceral endoderm,VE)的基因Sox7,說明通過此方法誘導(dǎo)后,分選得到的CXCR4+/c-Kit+細(xì)胞群

8、為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。 分選定形內(nèi)胚層細(xì)胞,比較懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)對肝祖細(xì)胞分化的影響。懸浮培養(yǎng)：將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在低貼附培養(yǎng)皿中,令其形成球狀克隆,培養(yǎng)基中加入bFGF、BMP-4生長因子,誘導(dǎo)48小時后,可明顯檢測到有關(guān)肝分化的基因(Proxl、Afp、Hnf4、Ttr)上調(diào),將球狀克隆貼附于I型膠原上,加入HGF、EGF繼續(xù)培養(yǎng)；單層貼壁培養(yǎng)：將細(xì)胞貼于鋪有I型膠原的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)基與單層培養(yǎng)方法一致；在培養(yǎng)12天時,可

9、在球狀克隆中檢測到ALB和CK19雙陽性的細(xì)胞,FACS分析ALB+/CK19+細(xì)胞比例為22％,而單層培養(yǎng)中并未看到ALB和CK19的表達(dá)。RT-PCR檢測表明,球狀克隆生長的內(nèi)胚層細(xì)胞分化程度要早于單層貼壁培養(yǎng)的內(nèi)胚層細(xì)胞。 利用體外ES細(xì)胞經(jīng)內(nèi)胚層分化為肝祖細(xì)胞的發(fā)育模式,研究Gata4和Gata6在肝臟形成中的作用。采用RNA干擾的方法,建立穩(wěn)定RNAi的ES細(xì)胞系,通過Q-PCR檢測到,在向內(nèi)胚層分化過程中,Gata4

10、和Gata6并沒有影響到DE基因Tm4sf2和Cxcr4的表達(dá),然而卻影響到了VE基因Emp2和Amn的表達(dá)；同時抑制Gata4和Gata6表達(dá)后,肝祖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因Afp、Hnf4、Ttr的表達(dá)均被降低,但單獨抑制一個因子則沒有很明顯的變化,說明在肝祖細(xì)胞分化過程中,Gata4和Gata6起到重要作用,并在功能上相互補(bǔ)償。 本實驗研究首次遵循胚胎肝臟發(fā)育過程,采用從胚胎干細(xì)胞經(jīng)內(nèi)胚層分化為肝祖細(xì)胞的方法,明確地產(chǎn)生同一發(fā)育