原代小鼠肝細(xì)胞包埋培養(yǎng)工藝研究.pdf

1、肝臟是體內(nèi)功能最多、最復(fù)雜的器官，是生理和病理狀態(tài)下，能量代謝，毒素的生物轉(zhuǎn)化以及血漿蛋白合成的中心器官。急性肝衰竭，晚期肝病或先天性肝病的致死率極高，原位肝臟移植是唯一的有效方法，然而這種方法的廣泛應(yīng)用受到供體肝臟短缺的限制，為此研究者們提出體外肝臟灌注、生物型人工肝、肝細(xì)胞移植等技術(shù)，以期為肝功能衰竭患者度過(guò)肝臟供體等待期或?yàn)楦闻K自行修復(fù)提供代謝支持。但由于肝細(xì)胞體外培養(yǎng)增生困難，而且難以維持功能，因此，如何獲得足夠數(shù)量和功能良好的

2、原代肝細(xì)胞已成為廣大學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 近年來(lái)，隨著對(duì)海藻酸鈉、殼聚糖性能及應(yīng)用研究的深入，以及固定化細(xì)胞和各種生物技術(shù)的發(fā)展，海藻酸鈉、殼聚糖在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的研究逐漸增加。海藻酸鈣微膠珠包埋細(xì)胞培養(yǎng)和海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉（ACA）微囊化細(xì)胞培養(yǎng)比普通培養(yǎng)能夠提供更多的貼壁表面積，最大可能地模擬了細(xì)胞生長(zhǎng)的三維微環(huán)境，為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供了依據(jù)。另外ACA微膠囊具有免疫隔離作用而成為目前細(xì)胞移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

3、
　　 本文以海藻酸鈉、殼聚糖為原料，研究海藻酸鈣微膠珠和ACA微膠囊的制備工藝，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行海藻酸鈣微膠珠包埋小鼠肝細(xì)胞和ACA微囊化小鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)，測(cè)定其細(xì)胞存活率及肝功能生化指標(biāo)，同時(shí)探討不同的初始培養(yǎng)密度對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響。
　　 研究了海藻酸鈣微膠珠制備的工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)，以海藻酸鈣微膠珠的平均強(qiáng)度和通透性為考察指標(biāo)，確定其最優(yōu)組合為A2B3C1，其影響趨勢(shì)為A>B>C，即海藻酸鈉

4、溶液濃度是最主要的影響因素，CaCl2溶液濃度次之，固定化時(shí)間影響最小。在該最優(yōu)組合，即海藻酸鈉溶液濃度1.75％，CaCl2溶液濃度3％，固定化時(shí)間30min條件下制備的微膠珠，平均強(qiáng)度為398g/c㎡，通透性A/Ao值為0.85，適合肝細(xì)胞的包埋培養(yǎng)。
　　 研究了ACA微膠囊制備的工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，以ACA微膠囊的膨脹度為考察指標(biāo)，確定其最優(yōu)組合為A2B2C1D2，其影響趨勢(shì)為D>C>B>A，即

5、海藻酸鈉溶液濃度為最主要的影響因素，中和反應(yīng)時(shí)間和成膜反應(yīng)時(shí)間次之，殼聚糖溶液濃度影響最小。在該最優(yōu)組合，即殼聚糖溶液濃度1.75％，成膜反應(yīng)時(shí)間8min，中和反應(yīng)時(shí)間4min，海藻酸鈉溶液濃度0.25％條件下所制備的ACA微膠囊膨脹度Sw值為1.125，適合ACA微囊化肝細(xì)胞的包埋培養(yǎng)。
　　 在上述海藻酸鈣微膠珠和ACA微膠囊制備條件下進(jìn)行原代小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)，與普通培養(yǎng)法比較發(fā)現(xiàn)：ACA微囊化肝細(xì)胞肝功能較穩(wěn)定，比普通培養(yǎng)和

6、海藻酸鈣微膠珠包埋培養(yǎng)的尿素和白蛋白分泌功能均強(qiáng)，而海藻酸鈣微膠珠包埋培養(yǎng)法又要優(yōu)于普通培養(yǎng)法。這充分說(shuō)明ACA微膠囊和海藻酸鈣微膠珠均有良好的生物相容性，能提供更多的貼壁表面積。
　　 同時(shí)對(duì)兩種包埋培養(yǎng)的初始培養(yǎng)密度進(jìn)行了研究。海藻酸鈣微膠珠包埋培養(yǎng)過(guò)程中不同的初始培養(yǎng)密度試驗(yàn)研究表明：初始培養(yǎng)密度為0.5×106～1.0×106/mL時(shí)為最佳的海藻酸鈣微膠珠包埋初始培養(yǎng)密度，且最佳的初始培養(yǎng)密度較普通培養(yǎng)要高出5倍。ACA

7、微膠囊培養(yǎng)過(guò)程中不同的初始培養(yǎng)密度試驗(yàn)研究表明：初始培養(yǎng)密度為1.5×106～2.0×106/mL時(shí)為最佳的ACA微膠囊初始培養(yǎng)密度，且最佳的初始培養(yǎng)密度較普通培養(yǎng)要高出15倍左右，較海藻酸鈣微膠珠包埋培養(yǎng)高出3倍左右。說(shuō)明ACA微膠囊內(nèi)部液態(tài)環(huán)境能夠更好的模擬體內(nèi)肝臟的生理環(huán)境，同時(shí)有利于外部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入和內(nèi)部代謝物質(zhì)的輸出。
　　 本試驗(yàn)為海藻酸鈉、殼聚糖在生物材料方面的開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)，對(duì)肝細(xì)胞體外培養(yǎng)理論與實(shí)踐方面的