乙型肝炎病毒X蛋白對(duì)原代小鼠肝細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的：目前關(guān)于HBx蛋白的研究多在永生化或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行，由于不同的研究體系得出的結(jié)論有所差異，所以我們以原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞作為研究系統(tǒng)，模擬正常的細(xì)胞環(huán)境，探討HBV復(fù)制過(guò)程中HBx蛋白對(duì)原代小鼠肝細(xì)胞周期的影響，以期闡釋HBx蛋白對(duì)HBV復(fù)制的影響機(jī)制。
　　方法：(1)培養(yǎng)原代小鼠肝細(xì)胞并用Western blot檢測(cè)周期蛋白的表達(dá)水平。(2)采用野生型HBV編碼質(zhì)粒(pHBV)和HBx蛋白表達(dá)缺失的HBV編碼質(zhì)粒(pHBV

2、△x)分別轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。(3)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞的周期蛋白表達(dá)水平。(4)Southern blot檢測(cè)兩組細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制水平。(5)Real-time PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制水平。
　　結(jié)果：(1)新鮮分離的肝細(xì)胞和原代培養(yǎng)24、48、72h的肝細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。(2)轉(zhuǎn)染48h后，pHBV組細(xì)胞與pHBV△X組細(xì)胞周期蛋白條帶灰度值相比，前者cyclin

3、D1、p21、cyclin E表達(dá)量較高，p16的表達(dá)量較低，統(tǒng)計(jì)量t值分別為15.713，22.897，14.680，-19.584，P值均< 0.05。(3)培養(yǎng)72 h后提取HBV DNA，Southern blot檢測(cè)HBV DNA復(fù)制中間體松散環(huán)狀DNA、雙鏈線性DNA、單鏈DNA的水平，經(jīng)條帶灰度掃描，pHBV組的水平（分別為3288.336 ± 448.011、6458.318 ± 182.163、2760.613 ± 3

4、93.561）明顯高于pHBV△X組（分別為515.721 ± 62.530、2122.228 ± 28.347、1632.013 ± 207.021）及空白對(duì)照組，P值均< 0.05；(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA復(fù)制水平，pHBV組 [每個(gè)細(xì)胞（987.50 ± 47.80）拷貝]也明顯高于pHBV△X組 [每個(gè)細(xì)胞（303.67 ± 33.94）拷貝]，t = 20.203，P < 0.05。
　　結(jié)論：HBx蛋