硫化氫對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪合成和分解的影響.pdf

1、背景：非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合癥中常見(jiàn)的一種疾病，現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)慢性肝病的重要病因，目前還沒(méi)有理想的預(yù)防和治療藥物。在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中，由胰島素抵抗及其它因素引起的肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成增加及沉積在疾病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。硫化氫（Hydrogen sulfide），化學(xué)分子式為H2S，是一種能在人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)合成的氣體分子遞質(zhì)，

2、可調(diào)控多種生理及病理生理過(guò)程。有研究顯示，內(nèi)源性H2S或外源性H2S供體的補(bǔ)充，可在生理或病理生理?xiàng)l件下影響肝臟正常的脂質(zhì)代謝。然而，H2S改變及控制肝臟脂質(zhì)代謝的機(jī)制尚不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道在大鼠脂肪細(xì)胞中，抑制胱硫醚γ裂解酶（Cystathionine-gamma-lyase，CSE）/H2S系統(tǒng)可通過(guò)PKA-脂肪包被蛋白/激素敏感性脂肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）途徑增強(qiáng)脂肪分解作用，增加血脂水平，從

3、而使肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷增加，患NAFLD風(fēng)險(xiǎn)增加。而給予H2S供體則會(huì)降低脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪分解作用，這樣就有可能降低NAFLD風(fēng)險(xiǎn)。由此課題組推測(cè)，外源性H2S可能會(huì)影響到肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成及分解代謝。肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度蓄積可以抑制細(xì)胞自噬，H2S作為一種氣體分子遞質(zhì)，可激活細(xì)胞自噬，但是否能通過(guò)改變肝細(xì)胞的自噬水平來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的脂肪代謝目前還不清楚。
　　目的：探究H2S對(duì)肝細(xì)胞脂肪合成和分解代謝的影響以及細(xì)胞自噬對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的

4、影響，為進(jìn)一步了解H2S在NAFLD的作用及開(kāi)發(fā)H2S供體治療藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：兩步原位灌流法分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞，體外用油酸（Oleic acid，OA）誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型。研究 H2S對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成影響時(shí)細(xì)胞分四組：對(duì)照組，給予等體積的培養(yǎng)液和10％的BSA，用于替換模型組所用的含1.2mmol/L的油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液；模型組，用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的

5、培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞48h；H2S組和PAG組是指用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞的同時(shí)分別給予1mM GYY4137和200μMPAG處理48h。油紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況，比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量，觀察脂肪分解的實(shí)驗(yàn)也分四組：對(duì)照組，給予等體積的培養(yǎng)液和10%的BSA，用于替換模型組所用的含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液；模型組，用含1.2mmol/L油酸（

6、溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞48h；H2S組和PAG組是用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液孵育原代肝細(xì)胞48h，然后換無(wú)血清無(wú)酚紅的RPMI1640培養(yǎng)液同時(shí)分別給予1mM GYY4137和200μM PAG處理6h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)其中甘油含量，取細(xì)胞爬片做LC3免疫熒光，拍攝相差圖片；同時(shí)離心收集細(xì)胞制作電鏡標(biāo)本；用Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞中LC3A/B、HS

7、L和p-HSL的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：⑴用含油酸濃度為1.2mmol/L的培養(yǎng)液誘導(dǎo)肝細(xì)胞48h，油紅染色顯示細(xì)胞體積增大，輪廓模糊，胞質(zhì)中有大量脂滴形成，小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變性模型建立成功。⑵在觀察脂肪合成的實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模型組肝細(xì)胞中甘油三酯含量明顯增高（P<0.05）；而與模型組相比，H2S組和PAG組肝細(xì)胞中TG含量無(wú)明顯變化。⑶在觀察脂肪分解的實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模型組甘油釋放量顯著增加（P<0.05），H2

8、S組與模型組相比甘油釋放量顯著減少（P<0.05）.Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組 HSL的磷酸化水平明顯升高（P<0.05）；H2S組與模型組相比，HSL的磷酸化水平顯著降低（P<0.05）。⑷LC3免疫熒光、Western blotting結(jié)果顯示，H2S促進(jìn)肝脂肪變性細(xì)胞LC3熒光顆粒和蛋白表達(dá)增加，相差顯微鏡下顯示細(xì)胞內(nèi)空泡增多，電鏡顯示自噬溶酶體數(shù)量增加。這些結(jié)果表明，H2S能夠促進(jìn)原代肝脂肪變