肺炎衣原體包涵體膜蛋白CPn0308的鑒定及其相關(guān)特性的研究.pdf

1、肺炎衣原體是一類嚴格的活細胞內(nèi)寄生的、具有獨特生活周期的微生物.其復制和生物合成是在被感染的宿主細胞內(nèi)形成的包涵體中進行的,因此包涵體是衣原體賴以生存和繁殖的微環(huán)境,為了建立和維持衣原體在感染細胞包涵體內(nèi)的生長,就必須通過包涵體膜與宿主細胞進行物質(zhì)和信號的交換.自從1995年Rochey等用實驗首次證實衣原體通過自身表達的蛋白而主動修飾包涵體膜以來,陸續(xù)有新的包涵體膜蛋白被鑒定出來,并對部分包涵體膜蛋白的生物學作用進行了研究,初步顯示包

2、涵體膜蛋白參與與宿主間的相互作用及其致病性。 CPn0308是預測的包涵體膜蛋白,是否定位于包涵體膜上尚有待于進一步確認.為此本研究在檢索CPn基因庫信息的基礎上,分析CPn0308及其相關(guān)基因的特性；克隆CPn0308及其相關(guān)基因并表達其GST融合蛋白；制備多克隆和單克隆抗體,對內(nèi)源性蛋白的表達進行定位；在定位的基礎上對其特性進一步研究,以期為更全面了解衣原體包涵體膜蛋白的生物學作用提供信息。 第一部分CPn0308及

3、其相關(guān)基因的克隆與表達 目的:分析和克隆CPn0308和與其相關(guān)的其他衣原體基因(包括CT249、MoPn052和GPIC0474)的基礎上,進一步表達相關(guān)的蛋白,為后續(xù)制備抗體、鑒定包涵體膜蛋白奠定基礎。 方法:①依據(jù)文獻提供的信息,檢索CPn0308信息,根據(jù)檢索提示,進行相關(guān)分析.②選擇肺炎衣原體CPn0308基因的開放讀碼框架區(qū)的基因和相關(guān)基因CT249、MoPn0520、GPIC0474以及所用的克隆和表達載體

4、pGEX-6P2設計引物；采用PCR方法獲取目的基因。③采用常規(guī)的酚-氯仿法提純擴增的目的基因,進行限制性內(nèi)切酶酶切處理。④用T4連接酶連接純化后的消化產(chǎn)物與預處理的pGEX-6P2載體,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL1-blue,接種在含有100μg/ml AMP的選擇性培養(yǎng)基LB平板上,37℃過夜培養(yǎng).⑤采用針對pGEX-6P2載體的PCR初步篩選選擇性培養(yǎng)基上生長的克隆；對PCR擴增陽性的克隆提取質(zhì)粒,進一步采用交叉-PCR進行鑒定；交叉

5、PCR擴增陽性的質(zhì)粒進行測序并進行序列分析。⑥用IPTG誘導序列正確的克隆表達GST重組蛋白,用Glutathione Sepharose TM 4B純化重組蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。 結(jié)果:①CPn0308基因長度為366bps,編碼121個氨基酸殘基,分子量為12.971kDa。CT249、GPIC0474和MoPn0520在基因結(jié)構(gòu)與CPn0308具有相似性。一個基因獨自為一個基因群,兩側(cè)均為已知的基因glgP和

6、dnaA,編碼的氨基酸殘基數(shù)相似。②獲得了載體重組質(zhì)粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474。經(jīng)過用針對pGEX-6P2載體的引物初步篩選后進一步提取重組質(zhì)粒,經(jīng)過pGEX-6P2的引物和特異性引物進行交叉PCR擴增,獲得的擴增產(chǎn)物與預期結(jié)果一致。直接以重組質(zhì)粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/

7、MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474為模板進行測序,得到克隆片段的DNA序列,與基因庫中的序列比對的一致性均為100％,進一步分析發(fā)現(xiàn)均含有兩個跨膜區(qū)域。③選取陽性克隆誘導表達重組蛋白,經(jīng)過純化后進行SDS-PAGE電泳,顯示條帶與預期結(jié)果一致。 結(jié)論:①CPn0308及其相關(guān)的CT249、MoPn0520以及GPIC 0474基因結(jié)構(gòu)相似。②成功地將CPn0308以及CT249、MoPn0520和GPIC047

8、4克隆到pGEX-6P2載體中,并表達出GST-CPn0308等四個GST融合蛋白。 第二部分CPn0308、CT249、MoPn0520和GPIC0474抗體制備及應用 目的:本研究在第一部分克隆、表達蛋白基礎上進一步制備CPn0308及其相關(guān)蛋白的多克隆抗體以及CPn0308的單克隆抗體；采用抗體標記檢測法對四種內(nèi)源性蛋白進行初步定位分析,以期為深入探究這些假定蛋白的生物學作用奠定基礎。 方法:①用Gluta

9、thione Sepharose TM 4B純化融合蛋白GST-CPn0308、GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474作為免疫原,常規(guī)方法免疫Balb/C小鼠,分離血清獲得多克隆抗體.對GST-CPn0308蛋白,常規(guī)方法制備單克隆抗體.②采用IFA進行篩選陽性克隆和效價滴定。③用IFA方法對所獲取的單克隆抗體進行類別的鑒定；應用Western Blotting技術(shù)進行檢測抗體所識別的CPn0308的部位

10、特異性和識別部位的鑒定。④用所制備的抗體進行不同組合的IFA對四種抗體所對應的內(nèi)源性蛋白進行初步定位.進一步用吸附試驗和抗GST-CPn0308的多克隆抗體直接對四個不同種屬的衣原體(AR39、L2、MoPn和GPIC)感染后的HeLa細胞進行IFA分析CPn0308與其他三個蛋白的同源性。 結(jié)果:①IFA測試血清的效價如下:CPn0308、MoPn0520、CT249和GPIC0474分別為1:2000、1:200、1:200

11、0和1:200.②制備CPn0308的單克隆抗體獲得四株陽性雜交瘤細胞株,分別命名為2D7、3A6、3H5、5E10；單克隆抗體均為IgG類抗體,其中2D7為IgG3亞類、3A6為IgG1亞類、3H5和5E10均為IgG2b亞類；四株單克隆抗體識別CPn0308的部位均為CPn0308N,即靠近氨基端一側(cè)。③IFA結(jié)果顯示假定衣原體蛋白CPn0308、CT249和MoPn0520位于包涵體膜上,即包涵體膜蛋白,而GPIC0474則不位于

12、包涵體膜上。④與對照比較,用GST-CPn0308蛋白吸附GS7F-CPn0308的抗體未見包涵體膜蛋白的染色,而用GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474吸附后仍然可見GST-CPn0308的抗體的特異性包涵體膜蛋白的染色。用GST-CPn0308的多克隆抗體直接對不同種屬的衣原體感染的HeLa進行抗體染色,GST-CPn0308的多克隆抗體只識別AR39感染所形成的包涵體膜蛋白,而不識別其他三種衣原體感

13、染所形成的包涵體膜及其包涵體內(nèi)的衣原體。 結(jié)論:①成功制備出四株CPn0308的單克隆抗體(2D7、3A6、3H5和5E10),均為IgG類,識別CPn0308的氨基端。②用多克隆抗體對相應的蛋白進行定位,假定蛋白CPn0308、CT249、MoPn0520位于各自衣原體感染HeLa細胞形成的包涵體膜上,而假定蛋白GPIC0474則不在包涵體膜上.③試驗證實CPn0308與CT249、MoPn0520以及GPIC0474沒有同源

14、性。 第三部分假定蛋白CPn0308特性的初步研究 目的:使用抗體標記技術(shù)對假定蛋白CPn0308進行鑒定,并對其特性進行初步研究。 方法:①用含有R12AR39和CPn0308的多克隆抗體或單克隆抗體作一抗進行IFA,在熒光顯微鏡下觀察假定蛋白CPn0308在感染細胞內(nèi)的初步定位.②選用已經(jīng)鑒定的CPn蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60分別與CPn0308進行共染色.在激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋

15、白CPn0308與其他參照蛋白的定位情況.③使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染重組體pDsRed-C1/CPn0308和pDsRed-C1/CPn0186到HeLa細胞,在熒光顯微鏡下觀察CPn0308抗體的染色特性；通過吸附試驗觀察CPn0308抗體和IncA抗體對包涵體膜蛋白染色的特異性；采用Western Blotting技術(shù)檢測CPn0308抗體結(jié)合內(nèi)源性以及外源性蛋白的特異性.④分別在AR39感染HeLa細胞后的不同時間點進行

16、IFA實驗,觀察內(nèi)源性CPn0308蛋白的表達時相。 結(jié)論:①用CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體首次試驗證實假定蛋白CPn0308位于CPn感染HeLa細胞形成的包涵體膜上.②共定位發(fā)現(xiàn)CPn0308在包涵體上分布模式類似于IncA,而不同于參照蛋白CPAFcp、MOMP和HSP60.③CPn0308的表達時相為在感染后24h表達于包涵體膜上,并在后續(xù)的感染期間一直存在包涵體膜上。 第四部分感染肺炎衣原體人群中CP

17、n0308免疫原性的檢測分析 目的:在分析缺血性腦血管疾病(ICVD)患者肺炎衣原體感染的基礎上進一步分析CPn0308的免疫原性。 方法:①收集相關(guān)的臨床標本,分離血漿和提取外周血中單個核細胞(PBMC)中的DNA.②用肺炎衣原體的IgG和IgM診斷試劑盒檢測血漿中肺炎衣原體的感染情況.③用PCR法檢測分析外周血單個核細胞中肺炎衣原體DNA的存在情況.④用Western Blotting法分析內(nèi)源性蛋白CPn0308的