肺炎衣原體包涵體膜蛋白CPn0308的鑒定及其相關(guān)特性的研究.pdf

1、肺炎衣原體是一類嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生的、具有獨(dú)特生活周期的微生物.其復(fù)制和生物合成是在被感染的宿主細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體中進(jìn)行的,因此包涵體是衣原體賴以生存和繁殖的微環(huán)境,為了建立和維持衣原體在感染細(xì)胞包涵體內(nèi)的生長(zhǎng),就必須通過(guò)包涵體膜與宿主細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)和信號(hào)的交換.自從1995年Rochey等用實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)衣原體通過(guò)自身表達(dá)的蛋白而主動(dòng)修飾包涵體膜以來(lái),陸續(xù)有新的包涵體膜蛋白被鑒定出來(lái),并對(duì)部分包涵體膜蛋白的生物學(xué)作用進(jìn)行了研究,初步顯示包

2、涵體膜蛋白參與與宿主間的相互作用及其致病性。 CPn0308是預(yù)測(cè)的包涵體膜蛋白,是否定位于包涵體膜上尚有待于進(jìn)一步確認(rèn).為此本研究在檢索CPn基因庫(kù)信息的基礎(chǔ)上,分析CPn0308及其相關(guān)基因的特性；克隆CPn0308及其相關(guān)基因并表達(dá)其GST融合蛋白；制備多克隆和單克隆抗體,對(duì)內(nèi)源性蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位；在定位的基礎(chǔ)上對(duì)其特性進(jìn)一步研究,以期為更全面了解衣原體包涵體膜蛋白的生物學(xué)作用提供信息。 第一部分CPn0308及

3、其相關(guān)基因的克隆與表達(dá) 目的:分析和克隆CPn0308和與其相關(guān)的其他衣原體基因(包括CT249、MoPn052和GPIC0474)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步表達(dá)相關(guān)的蛋白,為后續(xù)制備抗體、鑒定包涵體膜蛋白奠定基礎(chǔ)。 方法:①依據(jù)文獻(xiàn)提供的信息,檢索CPn0308信息,根據(jù)檢索提示,進(jìn)行相關(guān)分析.②選擇肺炎衣原體CPn0308基因的開(kāi)放讀碼框架區(qū)的基因和相關(guān)基因CT249、MoPn0520、GPIC0474以及所用的克隆和表達(dá)載體

4、pGEX-6P2設(shè)計(jì)引物；采用PCR方法獲取目的基因。③采用常規(guī)的酚-氯仿法提純擴(kuò)增的目的基因,進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切處理。④用T4連接酶連接純化后的消化產(chǎn)物與預(yù)處理的pGEX-6P2載體,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞XL1-blue,接種在含有100μg/ml AMP的選擇性培養(yǎng)基LB平板上,37℃過(guò)夜培養(yǎng).⑤采用針對(duì)pGEX-6P2載體的PCR初步篩選選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克??；對(duì)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒,進(jìn)一步采用交叉-PCR進(jìn)行鑒定；交叉

5、PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行序列分析。⑥用IPTG誘導(dǎo)序列正確的克隆表達(dá)GST重組蛋白,用Glutathione Sepharose TM 4B純化重組蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。 結(jié)果:①CPn0308基因長(zhǎng)度為366bps,編碼121個(gè)氨基酸殘基,分子量為12.971kDa。CT249、GPIC0474和MoPn0520在基因結(jié)構(gòu)與CPn0308具有相似性。一個(gè)基因獨(dú)自為一個(gè)基因群,兩側(cè)均為已知的基因glgP和

6、dnaA,編碼的氨基酸殘基數(shù)相似。②獲得了載體重組質(zhì)粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474。經(jīng)過(guò)用針對(duì)pGEX-6P2載體的引物初步篩選后進(jìn)一步提取重組質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)pGEX-6P2的引物和特異性引物進(jìn)行交叉PCR擴(kuò)增,獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果一致。直接以重組質(zhì)粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/

7、MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474為模板進(jìn)行測(cè)序,得到克隆片段的DNA序列,與基因庫(kù)中的序列比對(duì)的一致性均為100％,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)均含有兩個(gè)跨膜區(qū)域。③選取陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,經(jīng)過(guò)純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,顯示條帶與預(yù)期結(jié)果一致。 結(jié)論:①CPn0308及其相關(guān)的CT249、MoPn0520以及GPIC 0474基因結(jié)構(gòu)相似。②成功地將CPn0308以及CT249、MoPn0520和GPIC047

8、4克隆到pGEX-6P2載體中,并表達(dá)出GST-CPn0308等四個(gè)GST融合蛋白。 第二部分CPn0308、CT249、MoPn0520和GPIC0474抗體制備及應(yīng)用 目的:本研究在第一部分克隆、表達(dá)蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備CPn0308及其相關(guān)蛋白的多克隆抗體以及CPn0308的單克隆抗體；采用抗體標(biāo)記檢測(cè)法對(duì)四種內(nèi)源性蛋白進(jìn)行初步定位分析,以期為深入探究這些假定蛋白的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。 方法:①用Gluta

9、thione Sepharose TM 4B純化融合蛋白GST-CPn0308、GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474作為免疫原,常規(guī)方法免疫Balb/C小鼠,分離血清獲得多克隆抗體.對(duì)GST-CPn0308蛋白,常規(guī)方法制備單克隆抗體.②采用IFA進(jìn)行篩選陽(yáng)性克隆和效價(jià)滴定。③用IFA方法對(duì)所獲取的單克隆抗體進(jìn)行類別的鑒定；應(yīng)用Western Blotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)抗體所識(shí)別的CPn0308的部位

10、特異性和識(shí)別部位的鑒定。④用所制備的抗體進(jìn)行不同組合的IFA對(duì)四種抗體所對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性蛋白進(jìn)行初步定位.進(jìn)一步用吸附試驗(yàn)和抗GST-CPn0308的多克隆抗體直接對(duì)四個(gè)不同種屬的衣原體(AR39、L2、MoPn和GPIC)感染后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行IFA分析CPn0308與其他三個(gè)蛋白的同源性。 結(jié)果:①IFA測(cè)試血清的效價(jià)如下:CPn0308、MoPn0520、CT249和GPIC0474分別為1:2000、1:200、1:200

11、0和1:200.②制備CPn0308的單克隆抗體獲得四株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2D7、3A6、3H5、5E10；單克隆抗體均為IgG類抗體,其中2D7為IgG3亞類、3A6為IgG1亞類、3H5和5E10均為IgG2b亞類；四株單克隆抗體識(shí)別CPn0308的部位均為CPn0308N,即靠近氨基端一側(cè)。③IFA結(jié)果顯示假定衣原體蛋白CPn0308、CT249和MoPn0520位于包涵體膜上,即包涵體膜蛋白,而GPIC0474則不位于

12、包涵體膜上。④與對(duì)照比較,用GST-CPn0308蛋白吸附GS7F-CPn0308的抗體未見(jiàn)包涵體膜蛋白的染色,而用GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474吸附后仍然可見(jiàn)GST-CPn0308的抗體的特異性包涵體膜蛋白的染色。用GST-CPn0308的多克隆抗體直接對(duì)不同種屬的衣原體感染的HeLa進(jìn)行抗體染色,GST-CPn0308的多克隆抗體只識(shí)別AR39感染所形成的包涵體膜蛋白,而不識(shí)別其他三種衣原體感

13、染所形成的包涵體膜及其包涵體內(nèi)的衣原體。 結(jié)論:①成功制備出四株CPn0308的單克隆抗體(2D7、3A6、3H5和5E10),均為IgG類,識(shí)別CPn0308的氨基端。②用多克隆抗體對(duì)相應(yīng)的蛋白進(jìn)行定位,假定蛋白CPn0308、CT249、MoPn0520位于各自衣原體感染HeLa細(xì)胞形成的包涵體膜上,而假定蛋白GPIC0474則不在包涵體膜上.③試驗(yàn)證實(shí)CPn0308與CT249、MoPn0520以及GPIC0474沒(méi)有同源

14、性。 第三部分假定蛋白CPn0308特性的初步研究 目的:使用抗體標(biāo)記技術(shù)對(duì)假定蛋白CPn0308進(jìn)行鑒定,并對(duì)其特性進(jìn)行初步研究。 方法:①用含有R12AR39和CPn0308的多克隆抗體或單克隆抗體作一抗進(jìn)行IFA,在熒光顯微鏡下觀察假定蛋白CPn0308在感染細(xì)胞內(nèi)的初步定位.②選用已經(jīng)鑒定的CPn蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60分別與CPn0308進(jìn)行共染色.在激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋

15、白CPn0308與其他參照蛋白的定位情況.③使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染重組體pDsRed-C1/CPn0308和pDsRed-C1/CPn0186到HeLa細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察CPn0308抗體的染色特性；通過(guò)吸附試驗(yàn)觀察CPn0308抗體和IncA抗體對(duì)包涵體膜蛋白染色的特異性；采用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)CPn0308抗體結(jié)合內(nèi)源性以及外源性蛋白的特異性.④分別在AR39感染HeLa細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行

16、IFA實(shí)驗(yàn),觀察內(nèi)源性CPn0308蛋白的表達(dá)時(shí)相。 結(jié)論:①用CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體首次試驗(yàn)證實(shí)假定蛋白CPn0308位于CPn感染HeLa細(xì)胞形成的包涵體膜上.②共定位發(fā)現(xiàn)CPn0308在包涵體上分布模式類似于IncA,而不同于參照蛋白CPAFcp、MOMP和HSP60.③CPn0308的表達(dá)時(shí)相為在感染后24h表達(dá)于包涵體膜上,并在后續(xù)的感染期間一直存在包涵體膜上。 第四部分感染肺炎衣原體人群中CP

17、n0308免疫原性的檢測(cè)分析 目的:在分析缺血性腦血管疾病(ICVD)患者肺炎衣原體感染的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析CPn0308的免疫原性。 方法:①收集相關(guān)的臨床標(biāo)本,分離血漿和提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的DNA.②用肺炎衣原體的IgG和IgM診斷試劑盒檢測(cè)血漿中肺炎衣原體的感染情況.③用PCR法檢測(cè)分析外周血單個(gè)核細(xì)胞中肺炎衣原體DNA的存在情況.④用Western Blotting法分析內(nèi)源性蛋白CPn0308的