優(yōu)化密碼沙眼衣原體主要外膜蛋白DNA疫苗免疫效果的研究.pdf

1、本研究為探索高效衣原體基因疫苗提供了新思路和實驗依據(jù)，對于新型衣原體DNA疫苗的研究具有重要意義。 一、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)與純化及小鼠生殖道感染模型的建立 (一)、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)、擴增與純化 我們在本實驗室成功建立了鼠型沙眼衣原體體外培養(yǎng)與純化的方法，為后續(xù)工作奠定了基礎。 人宮頸癌Hela229細胞用DEAE-葡聚糖處理后，感染一定劑量的鼠型沙眼衣原體，培養(yǎng)42-48小時衣原體即在細胞內

2、形成包涵體，完成其生活周期，擴增產生大量具感染性的原體。收集衣原體感染的Hela229細胞，超聲破碎細胞及衣原體包涵體壁，釋放衣原體原體顆粒，經(jīng)低溫超速離心、泛影鈉一泛影葡胺密度梯度離心分離純化得到衣原體。 在實驗過程中，我們對鼠型沙眼衣原體在hela229細胞內擴增及此后的純化的最佳實驗條件進行了摸索。結果可在每175cm<'2>的細胞培養(yǎng)瓶中擴增純化得到10<'8>IFU純度較高的鼠型沙眼衣原體，從而為此后的實驗工作打下基礎

3、。 (二)、鼠型沙眼衣原體生殖道感染小鼠模型的建立建立 在動物模型基礎上的疫苗免疫效果的評定是疫苗研究進程中必不可缺的一步。鼠型沙眼衣原體是沙眼衣原體的鼠生物變種，以小鼠為天然宿主，有利于研究病原體與宿主間的相互作用。利用鼠型沙眼衣原體建立的小鼠生殖道感染模型在國內外均有應用。但根據(jù)不同的實驗室報道，使用的衣原體滴度有很大差別。所以有必要在本實驗室建立Ct小鼠生殖道感染模型，以便更準確地評價疫苗的免疫效果。 本研

4、究通過陰道內接種感染鼠型沙眼衣原體，建立Ct生殖道感染小鼠模型。通過采用不同數(shù)量的衣原體包涵體形成單位(IFU)感染小鼠，探討建立生殖道感染模型的合適感染劑量。實驗結果表明，使用10<'5>IFU經(jīng)陰道感染6-8周齡雌性BALB/c小鼠即可造成輸卵管阻塞和輸卵管積水等并發(fā)癥。在感染后不同時間，生殖道組織出現(xiàn)不同的病理改變，主要的病理改變包括：感染早期，生殖道粘膜層水腫，粘膜層上皮細胞灶性壞死，糜爛；粘膜及粘膜下層中性粒細胞浸潤。后期以明

5、顯纖維組織增生，單核細胞浸潤粘膜及粘膜下層為主要表現(xiàn)。小鼠Ct生殖道感染模型的建立為評價Ct DNA疫苗的免疫保護作用奠定了基礎。 二、肌內免疫裸DNA疫苗比較優(yōu)化密碼和野生型MOMP DNA疫苗的免疫效果 通過優(yōu)化密碼促進外源蛋白在宿主細胞中的表達，增強DNA疫苗的免疫原性是提高DNA疫苗免疫效果的有效途徑之一。這在某些病毒DNA疫苗的相關研究中已取得可喜進展(如HIV、HPV等)。通過優(yōu)化密碼提高某些細菌DNA疫苗(

6、破傷風桿菌、李斯特胞內菌等)的免疫效果也已得到實驗研究的證實。但目前，國內外尚未見到衣原體優(yōu)化密碼基因疫苗的研究報道。在本課題組以往的工作中，我們首次分析比較了鼠型沙眼衣原體和人、小鼠(大鼠)等基因組偏愛密碼子的使用差異。根據(jù)人類基因密碼子使用偏好對沙眼衣原體基因進行了優(yōu)化，自行設計合成了優(yōu)化密碼鼠型沙眼衣原體MOMP基因。并成功構建了HuMOMP和野生型MOMP(WtMOMP)DNA疫苗。本研究在以上工作基礎上，進一步進行動物免疫試驗

7、，研究優(yōu)化密碼是否提高沙眼衣原體DNA疫苗的免疫效果；并對優(yōu)化密碼影響沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的機制進行了初步探索。 (一)、肌內免疫優(yōu)化密碼沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的研究 采用肌肉接種免疫的方式探討優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫作用。BALB/c小鼠分為四組：pcDNA3-HuMOMP免疫組、pcDNA3-WtMOMP免疫組、空載質粒陰性對照組和滅活衣原體原體陽性對照組。 研究結

8、果發(fā)現(xiàn)： 1、HuMOMP基因免疫組小鼠的DTH平均值以及脾淋巴細胞增殖SI值均明顯高于WtMOMP基因免疫組(P<0.05)；說明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能增強免疫小鼠的特異性細胞免疫。細胞因子檢測結果發(fā)現(xiàn)HuMOMP基因免疫組脾細胞培養(yǎng)上清中特異性IFN-γ水平顯著高于WtMOMP基因免疫組(P<0.05)，說明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能明顯增強Th1類細胞免疫反應。 2、小鼠血清特異性IgG抗體檢測結果表明

9、，與WtMOMP基因免疫組相比，HuMOMP基因免疫組IgG水平有所提高，體液免疫有一定程度的增強。但小鼠生殖道SIgA檢測在各組小鼠中均顯示為陰性結果。提示，經(jīng)肌內途徑接種MOMP DNA疫苗未能誘導生殖道粘膜產生特異性SIgA。 3、生殖道衣原體攻擊試驗結果發(fā)現(xiàn)，與空載質粒對照組相比，HuMOMP基因免疫組小鼠對衣原體生殖道的攻擊產生了部分保護作用，表現(xiàn)為生殖道衣原體定植減少，生殖道感染病理改變較輕。HuMOMP基因免疫組的

10、保護作用強于野生型MOMP基因免疫組，但兩者之間無顯著差異。 (二)、優(yōu)化密碼增強沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫原性的機制初探 以上研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化密碼能夠增強沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的免疫效應，但其機制如何尚不清楚。 為探討優(yōu)化密碼DNA疫苗免疫效應的增強是否與抗原蛋白的表達有直接的關系，我們比較了優(yōu)化密碼與野生型MOMP基因在小鼠肌肉內的表達水平。提取各免疫組小鼠肌肉組織總蛋白，作Western blo

11、t分析，結果發(fā)現(xiàn)：優(yōu)化密碼基因組可見明顯。MOMP蛋白條帶(約40KD)，而野生型基因組在相應分子量位置沒有肉眼可見的蛋白條帶，說明優(yōu)化密碼增強了MOMP蛋白在小鼠體內的表達水平。HuMOMP DNA疫苗免疫效果的增強與密碼修飾增加了MOMP蛋白在細胞中的表達水平有直接關系。我們進一步探討了優(yōu)化密碼增強哺乳動物細胞中衣原體蛋白表達的機制。采用熒光定量RT-PCR方法分析了HuMOMP基因和野生型MOMP基因在mRNA轉錄水平的表達。

12、 HuMOMP和WtMOMP基因轉染COS-1細胞，提取總RNA，反轉錄cDNA為模板，以β-actin為內參照，熒光定量RT-PCR結果顯示，優(yōu)化密碼MOMP基因的mRNA水平僅為野生型MOMP基因的1.36倍(而我們以往的研究結果證明優(yōu)化密碼MOMP基因的蛋白表達可增強至少10倍以上)。說明，在哺乳動物細胞內，此兩種MOMP基因在mRNA的表達水平?jīng)]有明顯差異。這與大多數(shù)學者在優(yōu)化密碼相關研究(HPV6b E7，BPV L1等)

13、中獲得的結論相一致，即在哺乳動物細胞中，野生型基因與人源化基因在mRNA表達水平無明顯差異，但在蛋白表達水平兩者差異明顯。提示，人源化優(yōu)化密碼基因蛋白表達增加的機制可能主要在轉錄后水平。具體哪些因素在轉錄后水平影響了MOMP蛋白的表達，我們將在以后的工作中進行深入研究。 三、粘膜免疫優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫效果和霍亂毒素B亞單位及CpG基因佐劑的增效作用 Ct感染后，細胞免疫和體液免疫共同參與針對Ct的特異性保

14、護性免疫應答，CD4<'+>Thl細胞免疫反應在清除Ct感染中起重要作用?？笴t MOMP SIgA的存在，減少了陰道感染率和相關的炎癥反應，在防御Ct感染中具有明顯作用。因此安全有效的Ct疫苗應引起Thl類反應占優(yōu)勢的保護性細胞免疫和強的粘膜SIgA反應。 研究結果發(fā)現(xiàn)： 1、CTB和CpG為佐劑的HuMOMP DNA疫苗免疫組小鼠(1)Ct特異性細胞免疫明顯增強，其中以Th1類細胞免疫占主要優(yōu)勢(IFN-γ明顯升高(

15、2037．03pg/ml)，為PBS組的136．5倍，為單獨HuMOMP免疫組的3倍；IgG2a明顯升高(OD值為0．98)，與Ct-EB陽性對照組相比無顯著差異(1．30，P>0.05)。(2)生殖道Ct特異性SIgA抗體升高(OD值為0．732)；與Ct-EB陽性對照組接近(0．88，P>0.05)。 (3)對Ct生殖道的攻擊具有較強免疫保護作用，甚至與Ct-EB陽性對照組的保護作用水平相當。表現(xiàn)為Ct生殖道的定植明顯減少、清除加快

16、；感染后第12天僅有生殖道局部少量炎細胞浸潤，未造成上行感染，輸卵管、卵巢基本正常。 2、單獨優(yōu)化密碼HuMOMP DNA疫苗鼻腔接種只能誘導低水平的細胞免疫及體液免疫，對Ct生殖道的攻擊的保護作用較低，感染后第12天陰道、子宮粘膜下有較多炎細胞浸潤，輸卵管壁增厚，有炎細胞浸潤。 以上結果說明，CTB和CpG佐劑能夠顯著增強優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗粘膜免疫的免疫效果：免疫小鼠產生以Th1類占主要優(yōu)勢的特異性細胞免疫及