豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的真核表達及間接ELISA方法的建立.pdf

1、ORF2基因編碼的蛋白是豬圓環(huán)病毒2型的主要結構蛋白，此蛋白具有較好的免疫原性。本實驗從重組質粒pMD18-T-ORF2切下ORF2基因片段，克隆到載體pEGFP-C1上，再切掉移碼的堿基，補平，自身連接轉入DH5a中。經(jīng)雙酶切、測序鑒定ORF2基因片段正確的克隆到pEGFP-C1載體上。將重組質粒pEGFP-C1-ORF2轉染到IBRS-2細胞中表達，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表達的蛋白約為59KD。經(jīng)Western-blot檢測，能夠

2、被PCV-2陽性血清所識別，具有良好的抗原性?！　±帽磉_的融合蛋白作為抗原，建立了檢測PCV-2抗體的間接ELISA方法，并對ELISA的反應條件進行了摸索，確定了抗原的最適包被濃度為3.6ug/ml，最適血清稀釋度為1：40，以酶標SPA作為二抗，最適工作濃度為1：80。包被的融合蛋白不與豬瘟、豬偽狂犬病、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的陽性血清發(fā)生交叉反應，重復性好，與IDEXX試劑盒相比，特異性為96％，敏感性為90％，兩