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![桑樹響應植原體侵染的新miRNAs的生物學功能研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/1/9/c52dbd08-9d57-41ca-8b88-73501a7fc476/c52dbd08-9d57-41ca-8b88-73501a7fc4761.gif)
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文檔簡介
1、桑樹黃化型萎縮病是由植原體引起的一種桑樹毀滅性病害,嚴重影響了蠶業(yè)生產的發(fā)展。目前有關植原體致病的分子機制仍不清楚。植物的miRNA作為一種重要的調控因子,在植物的生長發(fā)育、信號轉導以及環(huán)境響應等方面都扮演著十分重要的角色。本研究利用PCR技術克隆得到3個桑樹響應植原體侵染的新miRNAs(mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33)基因,并對其生物學功能進行了研究,初步明確了這3個miRNAs在植物響應逆境脅迫過程
2、中的作用,為揭示基于miRNA水平上的桑樹響應植原體侵染的調控機制奠定了基礎,對于促進桑樹功能基因組學研究及豐富和發(fā)展miRNA的生物學功能具有重要意義。
本文的主要研究結果如下:
(1)桑樹響應植原體侵染的新miRNAs的表達差異顯著性驗證
根據(jù)桑樹轉錄組高通量測序得到的3個響應植原體侵染的新miRNAs的基因序列,利用Northern blot和熒光定量PCR的方法對其在受植原體侵染葉片和健康桑樹葉片中
3、的表達差異顯著性進行了驗證。結果顯示,桑樹受植原體侵染后,mul-miRn8的表達量顯著上升,mul-miRn26和mul-miRn33的表達量均顯著降低。
(2)桑樹響應植原體侵染的新miRNAs基因在擬南芥中的異源表達分析
根據(jù)已有的桑樹轉錄組序列信息,通過PCR技術克隆得到mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33的基因,分別命名為MulMIRn8、MulMIRn26和MulMIRn3,構建
4、了其植物表達載體,并成功轉化了擬南芥,獲得了轉基因植株。通過Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)MulMIRn8、MulMIRn26和Mul MIRn33基因均能在轉基因擬南芥植株中高效表達;通過對mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33成熟體的熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),高效表達的3個mul-miRNAs基因均能夠在轉基因擬南芥中加工形成成熟體。
(3)桑樹響應植原體侵染的新miRNAs的生物學功能分析
5、為了研究桑樹響應植原體侵染的3個新miRNAs的生物學功能,我們對轉MulMIRn8、MulMIRn26和Mul MIRn3基因擬南芥分別進行了非生物脅迫(干旱和鹽脅迫)和生物脅迫(丁香假單胞桿菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000侵染)處理,結果發(fā)現(xiàn):與野生型植株相比,轉MulMIRn8擬南芥具有較強的抗Pst DC3000侵染能力和抗干旱脅迫的能力,但抗鹽能力與
6、野生型植株無明顯差別;與野生型植株相比,轉MulMIRn26擬南芥對于干旱脅迫和Pst DC3000侵染均表現(xiàn)出一定的抗性,但對鹽脅迫敏感;轉MulMIRn3擬南芥雖然具有較強的抗干旱脅迫、鹽脅迫能力,但對Pst DC3000侵染卻表現(xiàn)為較敏感。因此,桑樹響應植原體侵染的3個新miRNAs在植物響應逆境脅迫過程中均具有一定作用,但其生物學功能具有明顯差別。
(4)桑樹新miRNAs靶基因的生物學功能分析
為了進一步研
7、究桑樹響應植原體侵染的3個新miRNAs的作用機制,我們利用生物信息學技術對3個miRNAs的靶基因進行預測,發(fā)現(xiàn)mul-miRn8的靶基因MulBAH1是一種BAH結構域蛋白;mul-miRn26的靶基因MulZF1是一種含CCCH結構域的鋅指蛋白;mul-miRn33的靶基因MulDME1是一種轉錄激活因子(DEMETER)。利用Northern雜交分析,發(fā)現(xiàn)桑樹新miRNAs在轉基因擬南芥中成功表達后可以通過靶向擬南芥中的靶基因來
8、發(fā)揮其基因沉默功能。
根據(jù)已有的桑樹轉錄組序列信息,通過PCR技術克隆得到MulBAH1和MulZF1基因,構建了其植物表達載體,并成功轉化了擬南芥,獲得了轉基因植株。對轉基因植株和野生型植株進行干旱、鹽脅迫和Pst DC3000侵染處理,發(fā)現(xiàn)轉MulBAH1擬南芥植株具有較強的抗鹽脅迫的能力,但對干旱脅迫和病原菌的侵染較敏感;而轉MulZF1擬南芥植株對于鹽脅迫、干旱脅迫和Pst DC3000的侵染均有較強的抗性。因此,響應
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