桑樹病程相關基因非表達子基因MuNPR1的生物學功能研究.pdf

1、植物在生長發(fā)育過程中會受到各種病原物的侵染，在長期的生存進化中，植物形成了各種各樣的機制防御病原菌入侵。植物不同水平的多個抗病途徑交叉、重疊組成植物的抗病防御機制使植物表現出多種抗病形式。其中誘導抗性和基礎抗性是最為典型的兩種抗病形式。一般認為基礎抗性是指植物表現出的對病原菌的天然本底抗性，這種抗性是植物與生俱來的，即植物抵御病原物的侵染機制是利用植物本身的與眾不同的結構以及一些特殊化學成分,如果植物喪失了基礎抗性就會對病原菌表現出超感

2、病性。植物的誘導抗性機制是由于環(huán)境因子（包括生物因子和非生物因子）激活了植物的防御體系而產生對病原物的系統(tǒng)抗病性。病程相關基因非表達子1基因(NPR1)基因是植物抗病基因表達和系統(tǒng)獲得性抗性中的一個關鍵基因。NPR1不僅在植物系統(tǒng)獲得抗性和誘導系統(tǒng)抗性中起核心調控作用，而且是植物基礎抗性以及由抗病基因決定的抗性的重要調控因子。本研究根據已有的桑樹轉錄組信息，克隆得到桑樹 NPR1基因并將其命名為MuNPR1，利用生物信息學分析方法對該基

3、因及其編碼蛋白的理化特性進行了分析；同時構建了該基因的植物表達載體，采用農桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥，獲得了轉基因植株，研究了MuNPR1的生物學功能。研究結果為揭示桑樹MuNPR1的生物學功能奠定了基礎，為桑樹抗逆分子育種提供了有效候選基因。
　　本文的主要研究結果如下：
　?。?）桑樹MuNPR1的克隆及生物信息學分析
　　根據獲得的桑樹轉錄組信息，利用PCR技術克隆得到了桑樹病程相關基因非表達子1基因MuNP

4、R1（GenBank登錄號：JX204735)，該基因編碼區(qū)全長為1743 bp，編碼580個氨基酸，編碼蛋白理論分子質量為64.5 kDa，等電點為5.66。對該蛋白的結構進行預測分析發(fā)現，蛋白是由許多α-螺旋和延伸片段及少量的轉角由無規(guī)卷曲聯(lián)系在一起折疊形成，其二級結構中富含α-螺旋，其次為β-折疊和延伸片段，而轉角僅占4.46％。NPR1蛋白含有豐富的是亮氨酸，含量最少的是色氨酸。并且通過NCBI數據庫及SWISS-MODEL網站

5、對其所翻譯的蛋白進行同源分析，發(fā)現MuNPR1與擬南芥AtNPR1同源性較高，并且包含一個保守的錨蛋白重復序列結構域和一個BTB/POZ結構域，可能具有與擬南芥AtNPR1相似的生物功能。
　　（2）桑樹MuNPR1的組織表達特異性分析
　　通過熒光定量PCR技術，對桑樹根、芽、皮、花和葉中的MuNPR1的表達量進行分析。結果顯示MuNPR1的表達沒有明顯的組織特異性，在桑樹根、芽、樹皮、花和葉中均有表達，在桑樹花和樹皮中的

6、表達量沒有明顯差別，而在葉片中的表達量相對較低。
　?。?）桑樹MuNPR1基因的生物學功能分析
　　構建桑樹MuNPR1基因的植物表達載體并成功轉化了擬南芥，獲得轉基因植株。通過熒光定量PCR分析發(fā)現MuNPR1基因能夠在轉基因擬南芥中高效表達。MuNPR1在擬南芥中高效表達使植株表型發(fā)生明顯變化，使轉基因植株開花提前，生長周期變短。MuNPR1的高效表達提高了轉基因擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomona

7、s syringaepv. tomato DC3000，Pst DC3000）的抗性，胼胝質染色發(fā)現轉MuNPR1擬南芥植株在遭受Pst DC3000侵染時短時間內產生大量胼胝質來抵御病原菌的侵入。NBT染色和DAB染色檢測結果顯示因此，在植物遭受病原菌侵染時，MuNPR1有助于調節(jié)轉基因植株體內O2-和H2O2的積累，從而提高植物的抗病性。利用熒光定量PCR技術對轉 MuNPR1擬南芥中 PR的表達量進行分析，發(fā)現在正常情況下 MuN

8、PR1在擬南芥中的表達，能增加PR5基因的表達，但對PR1基因的表達沒有明顯影響，但在病原誘導下，轉MuNPR1擬南芥中PR1和PR5基因的表達量都明顯高于與野生型。因此，在生物脅迫下MuNPR1可能對其他抗病基因的表達具有調節(jié)作用。
　　通過對轉基因植株進行干旱和鹽分脅迫處理，發(fā)現轉MuNPR1基因擬南芥的抗旱和耐鹽能力明顯低于野生型植株。通過NBT和DAB染色結果顯示，轉MuNPR1基因植物在鹽分和干旱脅迫下植物體內H2O2和