植原體侵染對(duì)桑樹(shù)miRNAs表達(dá)譜和代謝組的影響研究.pdf

1、桑樹(shù)黃化型萎縮病是由植原體引起的毀滅性病害，由于植原體分離、培養(yǎng)困難，目前該病發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。植物miRNAs作為一種重要的調(diào)控因子，在植物防衛(wèi)體系中扮演重要角色。代謝物是細(xì)胞調(diào)控過(guò)程的終產(chǎn)物，其種類和數(shù)量變化是生物體對(duì)體內(nèi)外環(huán)境變化的最終響應(yīng)。
　　 本研究利用高通量測(cè)序的小RNA數(shù)字化分析技術(shù)，探討了植原體侵染對(duì)桑樹(shù)miRNAs表達(dá)譜的的影響，鑒定出了桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的miRNAs，初步揭示了基于miRNAs水平上

2、的桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的調(diào)控機(jī)制;同時(shí)利用代謝組學(xué)分析技術(shù)分析了植原體侵染引起的桑樹(shù)葉片和韌皮部汁液代謝組的變化，研究結(jié)果對(duì)于全面揭示桑樹(shù)黃化型萎縮病發(fā)生的分子機(jī)制具有重要意義，同時(shí)為桑樹(shù)功能基因組的研究奠定了基礎(chǔ)，為植原體病害的防治技術(shù)研究提供了參考。
　　 本文的主要研究結(jié)果是:
　　 (1)桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的miRNAs差異表達(dá)分析成功地構(gòu)建了感病和健康桑樹(shù)葉片小RNA文庫(kù)，并利用Illumina Solexa測(cè)序

3、技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了HiSeq測(cè)序。在感病和健康桑樹(shù)葉片中共鑒定了166種保守的miRNAs，分屬于146個(gè)miRNA家族。所鑒定的166種保守miRNAs中有62種miRNAs在感病和健康桑樹(shù)葉片中表達(dá)量差異顯著，其中在感病桑樹(shù)葉片中表達(dá)量升高的有25個(gè)，下降的有37個(gè);利用Mireap預(yù)測(cè)得到23個(gè)新的miRNAs，分屬于20個(gè)miRNA家族;在所鑒定的新miRNAs中有13個(gè)在感病和健康桑樹(shù)葉片中表達(dá)差異顯著，其中有6個(gè)miRNAs在受

4、植原體侵染的感病桑樹(shù)中上調(diào)，7個(gè)miRNAs下調(diào)，以上分析結(jié)果的可靠性通過(guò)定量PCR分析得到了證明。
　　 (2)差異表達(dá)miRNAs的靶基因功能分析根據(jù)已有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組信息和其他植物基因組信息，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)62個(gè)差異表達(dá)的保守miRNAs和13新miRNAs的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，分別預(yù)測(cè)到329和70個(gè)靶基因，根據(jù)靶基因的功能和調(diào)控的代謝途徑，可以分別將之歸為15和14類。這些靶基因的功能和所涉及的調(diào)控途徑主要是代謝、發(fā)

5、育、信號(hào)傳導(dǎo)等。本研究不僅證明了桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，并對(duì)miRNAs介導(dǎo)的桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的分子機(jī)制進(jìn)行了分析。
　　 (3)桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的miRNA前體基因的克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)已有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組信息，利用PCR技術(shù)克隆得到桑樹(shù)miR393a和miR393b前體基因，同時(shí)分別從桑樹(shù)基因組和cDNA文庫(kù)中克隆得到桑樹(shù)miR482前體基因并成功構(gòu)建了其植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究相關(guān)miRNAs在桑樹(shù)響

6、應(yīng)植原體侵染過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 (4)植原體侵染對(duì)桑樹(shù)代謝組影響的研究利用GC-MS技術(shù)分析了健康和感病桑樹(shù)葉片中極性代謝物，兩個(gè)樣品中共鑒定出153種代謝物;在鑒定的代謝物中，有18種只在感病桑樹(shù)葉片中檢測(cè)到，而健康葉片中特有的代謝物僅有5種;兩樣品共有的代謝物有130種，其中有65種代謝物濃度在兩樣品中差異明顯，在感病桑樹(shù)葉片中濃度升高的只有13種，在感病葉片中減少的有52種。采用相同的技術(shù)分析了健康和

7、感病桑樹(shù)韌皮部汁液中極性代謝物，兩個(gè)樣品中共鑒定出147種代謝物;18種代謝物只在植原體感染的桑樹(shù)汁液中檢測(cè)到，而在健康的桑樹(shù)汁液中則有15種特有的代謝物;在114種共有的代謝物中，有56種代謝物濃度有顯著變化;被侵染的桑樹(shù)汁液中有25種代謝物水平增加，31種代謝物水平降低。將不同株系健康和感病桑樹(shù)葉片及韌皮部汁液的代謝物成分含量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，桑樹(shù)葉片與韌皮部汁液樣品代謝組顯著不同，感病與健康植株樣品的代謝組也不同。在此基礎(chǔ)