海島棉H276A-H276B AFLP分析與分子標(biāo)簽發(fā)掘.pdf

1、棉花（Gossypium hirsutum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。棉花具有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)，利用棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，實(shí)現(xiàn)“三系”配套長(zhǎng)期以來(lái)是棉花育種家追求的目標(biāo)。揭示植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)機(jī)理，為人工創(chuàng)造CMS種質(zhì)資源及有效調(diào)控CMS的表達(dá)提供理論依據(jù)，是國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物CMS的重要研究方向。
　　本研究以劉冬梅等基于轉(zhuǎn)紅麻HcPDIL5-2a創(chuàng)造的海島棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系H276A為材料，

2、以其非轉(zhuǎn)基因保持系H276B（H276A的野生型）為對(duì)照，利用多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、靈敏度高的AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，選擇256對(duì)選擇性擴(kuò)增引物對(duì)其基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，得出如下主要研究結(jié)果:
　　1、AFLP標(biāo)記技術(shù)體系優(yōu)化
　　首先，本試驗(yàn)建立了棉花幼葉高純度、高質(zhì)量的基因組DNA提取方法，在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上結(jié)合純化柱式提取方法，所提取的DNA質(zhì)量可以滿足后續(xù)AFLP技術(shù)要求，完全適于其分析;其次，從模板用量、

3、酶切時(shí)間、連接產(chǎn)物及預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)等方面進(jìn)行優(yōu)化，建立了最適于本試驗(yàn)研究材料的AFLP標(biāo)記技術(shù)體系和反應(yīng)條件;最后，對(duì)變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染做了優(yōu)化，使顯影效果更佳。
　　2、H276A與H276B的AFLP分析
　　利用AFLP標(biāo)記技術(shù)，從DNA水平上對(duì)H276A、H276B進(jìn)行分析，在256對(duì)選擇性擴(kuò)增引物中，有17對(duì)引物能穩(wěn)定擴(kuò)增出差異條帶，共獲得24條有無(wú)差異條帶，其中H276A有13條，多態(tài)性比例占2.63％

4、; H276B有11條，多態(tài)性比例占2.23％。對(duì)差異片段進(jìn)行回收，最終成功回收到19條片段，大小主要集中在100-700bp之間。
　　3、差異片段克隆測(cè)序
　　純化回收后的目的片段經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè)，最終成功檢測(cè)到13個(gè)大小與回收片段相同的差異片段，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分析，共得到6個(gè)陸地棉細(xì)胞質(zhì)基因同源序列。分別是2條葉綠體同源序列（均為ndhH基因的編碼序列），4條線粒體同源序列（其中兩條相同c

5、cmC基因上游非編碼區(qū)序列，一條nad6與sdh3編碼區(qū)基因之間的一段非編碼區(qū)序列，一條rps3基因的編碼序列）。通過(guò)對(duì)兩個(gè)材料的差異片段進(jìn)行再克隆測(cè)序比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)堿基替換，5個(gè)堿基缺失的突變。
　　4、分子標(biāo)簽的開(kāi)發(fā)
　　基于海島棉H276A、H276B線粒體基因ccmC上游保守區(qū)91bp處存在的一個(gè)堿基替換的差異，開(kāi)發(fā)了兩個(gè)能特異區(qū)別海島棉不育系細(xì)胞質(zhì)的PCR分子標(biāo)簽。通過(guò)對(duì)5對(duì)與H276同質(zhì)異核的海島棉不育系與保持