豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1、ORF3及ORF5基因部分功能的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，目前尚無有效的疫苗防制該病。PCV2的全基因組為1767～1768bp，可能含11個(gè)閱讀框架，其中的許多讀框架的功能仍不十分清楚。本研究從病料中直接擴(kuò)增PCV2全基因組并進(jìn)行克隆，采用酶切缺失方法分別構(gòu)建ORF1、ORF3、ORF5基因缺失突變毒株，通過PCR檢測(cè)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)以及透射電鏡觀察，鑒定其對(duì)IBRS．2細(xì)胞

2、的感染性，并進(jìn)行動(dòng)物接種試驗(yàn)，研究其對(duì)仔豬的致病性及免疫原性。目的是為研究上述基因的功能，探討其對(duì)病毒復(fù)制能力及致病力的影響，同時(shí)為構(gòu)建新型基因工程疫苗候選毒株提供新的方法和理論依據(jù)。 設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物(AF-P1/AF-P2)，并引入便于后期操作的SacⅡ酶切位點(diǎn)。從成都地區(qū)某豬場(chǎng)送檢的，經(jīng)多重PCR方法檢測(cè)為PCV2陽性的病料中一次性擴(kuò)增獲得了1 767bp的PCV2全基因組(命名為：PCV2-CD)。將其克隆到pMD1

3、8-T Simple載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMDl8-T Simple．PCV2-CD，并進(jìn)行了酶切鑒定和測(cè)序鑒定。核苷酸序列分析表明：PCV2-CD株與Genbank中公布的其它12個(gè)PCV2毒株間的同源性高達(dá)95．O％～100％。 采用EcoRV、Bmg BI雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T Simple．PCV2-CD，缺失堿基187bp，獲取4 272bp目的線性DNA片段，回收平端連接環(huán)化構(gòu)建了ORFl基因缺失重組質(zhì)粒pM

4、D18-T Simple-PCV2-CD-A；分別采用Nco I和BstB I單酶切pMDl8-TSimple-PCV2-CD獲取4 459bp線性目的DNA片段，補(bǔ)平、連接環(huán)化分別構(gòu)建了ORF3、ORF5基因插入缺失重組質(zhì)粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-C和pMD18-TSimple-PCV2-CD-E。新構(gòu)建的3個(gè)基因缺失重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序鑒定均證實(shí)構(gòu)建正確。用Sac Ⅱ酶切重組質(zhì)粒pMD18-T Simple

5、-PCV2-CD-A、pMD18-TSimple-PCV2-CD-C和pMD18-T Simple-PCV2-CD-E，獲得基因缺失后的PCV2-CD的線性基因組。分別回收1580bp、177lbp和1769bp的目的片段，經(jīng)體外連接環(huán)化構(gòu)建了ORF1、ORF3、ORF5基因缺失突變毒株mPCV2-A、mPCV2-C、mPCV2-E。三個(gè)基因缺失突變毒株分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞(PCV1和PCV2檢測(cè)陰性)培養(yǎng)并盲傳。經(jīng)P

6、CR檢測(cè)、PCR-RFLP分析，在分別轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)并盲傳4代的細(xì)胞中，特異性地檢測(cè)到mPCv2-A、mPCV2-C、mPCV2-E的DNA，并能與親本毒株P(guān)CV2-CD相區(qū)別；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)、盲傳6代的IBRS-2細(xì)胞胞核或胞漿中存在PCV2各缺失突變毒株的病毒顆粒。鑒定結(jié)果表明，構(gòu)建的3個(gè)PCV2基因缺失突變毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E具有感染性，能夠在IBRS-2細(xì)胞中復(fù)制增殖。發(fā)現(xiàn)ORF5基因、并證實(shí)ORF

7、3基因不是PCV2復(fù)制的必需基因；ORFl中187bp的缺失對(duì)PCV2的復(fù)制未產(chǎn)生明顯的影響。 24頭28～30日齡健康仔豬(PCVl、PCV2檢測(cè)為陰性)，隨機(jī)分成5組。其中，A、B、C組為試驗(yàn)組(5頭/組)，各組每頭分別肌肉注射mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E細(xì)胞培養(yǎng)物2ml；D組為PCV2-CD對(duì)照組(5頭)，每頭肌肉注射PCV2-CD細(xì)胞培養(yǎng)物2ml；E組為陰性對(duì)照組(4頭)，每頭肌肉注射生理鹽水2ml。A

8、、B、C、D四個(gè)組中各有一頭豬在接種后10d(10DPI)進(jìn)行屠宰，采集組織器官用于病毒在體內(nèi)復(fù)制增殖的檢測(cè)及組織病理學(xué)觀察；分別于接種后第0d、7d、14d和21d采集試驗(yàn)豬前腔靜脈血進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群以及PCV2抗體的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，數(shù)據(jù)用DPSv6.55統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。 結(jié)果表明：用已建立的PCR和PCR-RFLP方法，分別從各試驗(yàn)組接種后10天(10DPI)屠宰仔豬的腹股溝淋巴結(jié)中特異性檢測(cè)到基因缺失突變毒株DNA，發(fā)現(xiàn)

9、基因缺失突變毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E能夠在仔豬體內(nèi)復(fù)制增殖，基因缺失突變未影響病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制增殖。組織病理學(xué)觀察表明，三個(gè)試驗(yàn)組(mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E組)屠宰仔豬淋巴結(jié)顯現(xiàn)次級(jí)淋巴小結(jié)數(shù)量減少和/或生發(fā)中心的擴(kuò)大，肝細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性和水泡變性，肺泡壁上皮細(xì)胞腫脹并見淋巴細(xì)胞浸潤，脾臟、腎臟和心臟組織未見病理變化；PCV2-CD組的病變較嚴(yán)重。基因缺失未改變突變毒株的組織侵蝕途徑，并

10、顯示基因缺失可導(dǎo)致病毒致病力的降低。 用流式細(xì)胞儀(FACS)對(duì)外周血中CD<'3+>、CD<'4+>及CD<'8+>T淋巴細(xì)胞亞群百分含量動(dòng)態(tài)檢測(cè)表明，基因缺失對(duì)病毒的細(xì)胞免疫功能未產(chǎn)生影響，mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E有誘導(dǎo)仔豬細(xì)胞免疫應(yīng)答的趨勢(shì)。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)外周血中PCV2抗體的動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因缺失毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-F均明顯地誘導(dǎo)了仔豬的體液免疫，具有良