豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF6、ORF5基因的克隆、核酸疫苗構(gòu)建及鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)主要引起母豬的繁殖障礙，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)PRRS的防治尚無切實(shí)有效的方法，主要采取疫苗免疫接種和綜合防治相結(jié)合的方法。用于該病防制的疫苗主要是滅活苗和弱毒苗。但滅活苗主要引起體液免疫，而豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)具有抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)，因此在PRRS防治上受到一定的限制。而弱毒苗主要是在安全方面存在一定的問題，例如在接種弱毒疫苗后造成經(jīng)胎盤感染胎兒等，對(duì)繁殖性能造

2、成不利影響，精液帶毒和精液質(zhì)量下降現(xiàn)象，還可能造成疫苗毒的傳播，引起PRRSV的持續(xù)感染和病毒血癥，有些豬群出現(xiàn)急性PRRS樣綜合癥狀。所以對(duì)弱毒疫苗在推廣使用前必須進(jìn)行大量全面的試驗(yàn)研究。因此對(duì)PRRS等免疫抑制性疾病的防制，常規(guī)疫苗不能起到較好的效果。由于核酸疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，可以對(duì)不同血清型的毒株產(chǎn)生交叉保護(hù)性，因此核酸疫苗有望成為重要研究方向。 本研究首先根據(jù)已發(fā)表的PRRSV國(guó)內(nèi)分離株HB-1株的核苷酸

3、序列，設(shè)計(jì)了引物，用RT-PCR的方法擴(kuò)增了PRRSV長(zhǎng)春分離株ORF6、ORF5兩個(gè)重要的免疫原性基因，經(jīng)凝膠電泳回收后克隆到pMD-18T載體上，經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定。序列分析表明PRRSV長(zhǎng)春分離株與標(biāo)準(zhǔn)美洲株的核苷酸與氨基酸同源性較高，ORF6基因核苷酸序列的同源性達(dá)95.4％，ORF5基因核苷酸序列的同源性達(dá)89.6％：ORF6基因氨基酸序列的同源性達(dá)97.1％，ORF5基因氨基酸序列的同源性達(dá)89.1％。表明PRRSV長(zhǎng)

4、春分離株屬于美洲型。 將ORF6基因克隆至真核表達(dá)載體pVAX1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-ORF6。輔以超抗原SEA構(gòu)建了含內(nèi)源性佐劑的重組質(zhì)粒pVAX1-SEA-ORF6，同時(shí)將ORF6、0RF5基因串聯(lián)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX-SEA-ORF6-ORF5，將構(gòu)建的三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過IFA，RT-PCR檢測(cè)方法表明，所構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)了目的蛋白(M)、 (GP5)。