豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3、ORF5基因的克隆、核酸疫苗構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究.pdf

1、本文根據(jù)已發(fā)表的PRRSV國(guó)內(nèi)分離株BJ-4株的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，用RT-PCR的方法擴(kuò)增了PRRSV長(zhǎng)春分離株ORF5、ORF3兩個(gè)重要的免疫原性基因，經(jīng)凝膠電泳回收后克隆到pMD-18T載體上，酶切鑒定證實(shí)后進(jìn)行序列測(cè)定。序列分析表明PRRSV長(zhǎng)春分離株與標(biāo)準(zhǔn)美洲株的氨基酸同源性較高，ORF3基因氨基酸的同源性達(dá)92.4％，ORF5基因氨基酸的同源性達(dá)88.7％，表明PRRSV長(zhǎng)春分離株屬于美洲型。 將擴(kuò)增后獲得的

2、PRRSV長(zhǎng)春分離株ORF5、ORF3基因，克隆到真核表達(dá)載體pVAX1及pVIR-IL-18的啟動(dòng)子CMV下游，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ORF5、pVAX1-ORF5-ORF3及含有豬白細(xì)胞介素IL-18的核酸疫苗pVIR-IL18-ORF5、pVIR-IL18-ORF5-ORF3。通過(guò)Western-blot以及IFA等檢測(cè)方法確認(rèn)，所構(gòu)建的4個(gè)重組DNA疫苗質(zhì)粒在真核細(xì)胞能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)了目的蛋白(GP5)、(GP3

3、)。 將所構(gòu)建的4個(gè)重組DNA疫苗質(zhì)粒進(jìn)行了Balb/c小鼠免疫試驗(yàn)，檢測(cè)了免疫后的ELISA抗體水平和脾T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量。結(jié)果表明：共表達(dá)豬IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5、pVIR-IL18-ORF5-ORF3免疫后的ELISA抗體水平和脾T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量均優(yōu)于pVAX1-ORF5，pVAX1-ORF5-ORF3。所構(gòu)建的核酸疫苗體液免疫水平不如滅活苗理想，細(xì)胞免疫水平好于滅活苗說(shuō)明所構(gòu)建的核酸苗能