豬流行性腹瀉病毒S、M、ORF3基因的克隆和序列分析.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起，臨床上以豬的嘔吐、腹瀉和脫水為主要特征的急性接觸性腸道傳染病，對(duì)哺乳仔豬的致死率可達(dá)100％，給當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年以來(lái)，該病的發(fā)病率明顯升高，在免疫豬場(chǎng)也有發(fā)病報(bào)道，發(fā)病仔豬以腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征，死亡率達(dá)80％以上，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。為了解我國(guó)新發(fā)疾病的病原及其主要基因的特征，作者對(duì)我國(guó)華中、華南和西南等地區(qū)12個(gè)省市的13個(gè)流行毒

2、株的主要基因即S基因、M基因和ORF3基因進(jìn)行了測(cè)序和序列分析。其中，S蛋白介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的吸附和融合，并能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體;M蛋白是病毒含量最高的蛋白，是跨膜蛋白，在病毒裝配及出芽過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，該蛋白也是PEDV刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體保護(hù)的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一;ORF3基因所編碼的蛋白為一種跨膜蛋白，該蛋白具有離子通道活性，并與病毒毒力相關(guān)。
　　 參考GenBank中登錄的CV777全基因組序列(AF353511.1)，本

3、研究設(shè)計(jì)擴(kuò)增PEDV S基因、ORF3基因和M基因的引物。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，分別建立了S基因、ORF3基因和M基因全長(zhǎng)擴(kuò)增的RT-PCR方法，用其擴(kuò)增PEDV的目的基因，并進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測(cè)序，成功克隆并測(cè)定了13個(gè)毒株的S基因、ORF3基因和M基因的序列。測(cè)序結(jié)果表明，13個(gè)毒株之間的S基因核酸序列同源性為93.2％-99.9％，ORF3基因的核酸序列同源性為89.9％-100％，M基因的核酸序列同源性為97.7％-100％，與

4、毒株CV777相比，S基因、ORF3基因和M基因的核酸序列同源性分別為:93.8％-96.8％、90.8％-97.2％和98.1％-99.1％，氨基酸序列同源性分別為:92.3％-95.8％、86.8％-100％和98.2％-99.6％。其中毒株CH3和CH4與韓國(guó)疫苗毒株atenuated DR13 ORF3相比較，氨基酸序列同源性分別為100％和99.6％，均有138個(gè)氨基酸的缺失，說(shuō)明這兩個(gè)毒株可能來(lái)源于疫苗毒株DR13。毒株CH

5、1，CH8，CH17和CH18，與經(jīng)典毒株CV777相比，S基因具有共同的序列特征，其中包括53個(gè)點(diǎn)突變、2處共5個(gè)氨基酸插入（包括第59-62位氨基酸中4個(gè)氨基酸的插入和第141位氨基酸的插入）和第164-165位2個(gè)氨基酸的缺失。由于它們具有共同的氨基酸變異，與國(guó)內(nèi)2010年以前的毒株測(cè)序的同源性較低，在免疫豬場(chǎng)和非免疫豬場(chǎng)中均致病，并且具有高死亡率，我們將其定義為變異毒株。除了4個(gè)變異毒株外，同時(shí)發(fā)現(xiàn)9個(gè)經(jīng)典毒株，結(jié)果表明，臨床上

6、變異毒株和經(jīng)典毒株共存，提示豬流行性腹瀉在中國(guó)流行情況非常復(fù)雜。另外，2010年以后所測(cè)定的毒株序列，在ORF3和M基因分別有7處和3處點(diǎn)突變，至于點(diǎn)突變所引起毒株生物學(xué)特性的變化有待于進(jìn)一步研究。
　　 通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)變異毒株的S基因具有相似的變異特征，S基因存在插入、缺失和突變，可能導(dǎo)致現(xiàn)有基于CV777的疫苗不能提供良好的抗體保護(hù)，同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與韓國(guó)疫苗毒株DR13類(lèi)似的毒株在臨床上存在，進(jìn)一步增加了臨床控制PED的難度;