山羊生長激素基因乳腺特異性基因打靶載體的構建及陽性細胞株的篩選.pdf

1、研究表明生長激素(growth hormone，GH)可作用于乳腺間質(zhì)細胞的GH受體，誘導細胞產(chǎn)生胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor1，IGF-1)，刺激乳腺腺泡的發(fā)育和增加乳腺血流量，達到維持泌乳和提高奶產(chǎn)量的作用。 本研究首先利用基因打靶技術將山羊GH基因定點導入山羊β-酪蛋白基因座中，構建乳腺特異性基因打靶載體pLG，然后在細胞和乳腺組織中進行功能驗證。最后將pLG轉(zhuǎn)染山羊耳皮成纖維細胞進行

2、篩選，為今后培育轉(zhuǎn)GH山羊奠定試驗基礎。本研究中主要試驗內(nèi)容分為以下三部分:
　　 1.山羊β-酪蛋白基因5’和3’調(diào)控元件克隆及功能驗證
　　 本試驗的目的是擴增山羊β-酪蛋白的3’和5’調(diào)控元件，構建乳腺特異性打靶載體pGFP，通過綠色熒光蛋白(GFP)的表達驗證β-酪蛋白基因調(diào)控元件的功能。首先從新鮮采集的肝素抗凝山羊血中提取山羊基因組DNA，PCR擴增其3’和5’調(diào)控元件進行測序并分別雙酶切插入打靶載體pLOXP

3、Ⅱ的SalⅠ/ClaⅠ與NotⅠ/XhoⅠ多克隆位點，得到的載體命名為pL5。然后將GFP序列通過XhoⅠ單酶切插入pL5載體的XhoⅠ多克隆位點，得到的載體命名為pGFP。將載體pGFP通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Bcap-37細胞，6小時后換液去除脂質(zhì)體并加入10％胎牛血清，轉(zhuǎn)染后36小時在熒光顯微鏡觀察。測序結果表明PCR擴增得到的山羊β-酪蛋白基因的3’和5’端調(diào)控元件序列，與GenBank中公布的相應序列同源性在99.5％以上，可以作為基

4、因打靶載體的兩側(cè)同源臂使用。pGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞熒光強度顯著高于對照組，證明克隆的山羊β-酪蛋白基因3’與5’調(diào)控元件具有在細胞水平指導外源基因表達的生物學活性。
　　 2.山羊GH基因乳腺特異性打靶載體pLG的構建及其生物學功能驗證
　　 將GH cDNA酶切插入pLG載體XhoⅠ多克隆位點，得到GH基因乳腺特異性打靶載體并將其命名為pLG。構建的乳腺特異性基因打靶載體pLG質(zhì)粒采用月旨質(zhì)體法，分別導入人乳腺癌細胞B

5、cap-37和泌乳期山羊乳腺，轉(zhuǎn)染后提取細胞裂解液和乳腺組織，采用RT-PCR和ELISA方法檢測GH轉(zhuǎn)錄和表達水平。結果顯示與空白組相比，轉(zhuǎn)染pLG質(zhì)粒組在細胞(P＜0.01)和乳腺組織中(P＜0.05)GH轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量均顯著提高，表明載體pLG可在乳腺細胞上和乳腺組織中成功轉(zhuǎn)錄和表達GH。試驗結果顯示構建的山羊GH基因乳腺特異性打靶載體可以應用到后續(xù)的轉(zhuǎn)GH基因奶山羊生產(chǎn)研究中。
　　 3.山羊GH基因乳腺特異性打靶

6、載體pLG轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞和細胞篩選
　　 將pLG質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，轉(zhuǎn)染后36h加入G418(600ng/mL)進行正篩選，10d后山羊胎兒成纖維細胞出現(xiàn)明顯單克隆集落。將G418濃度降至300ng/mL并加入丙氧鳥苷(4umoL/mL)負篩選，7d后挑取單克隆集落消化傳代至48孔細胞培養(yǎng)板進行連續(xù)擴培，擴培至6孔板后提取單克隆基因組DNA并凍存細胞。試驗結果表明共篩選到36個單克隆細胞株，PCR檢