結(jié)核患者TCRγ9基因CDR3譜型分析及表達(dá)結(jié)核特異性γδTCR細(xì)胞株的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的：
　　 20世紀(jì)40年代中后期，結(jié)核病的控制措施不斷完善，結(jié)核病曾一度被抑制，但從80年代中后期開始，隨著人口遷移、艾滋病病毒和結(jié)核分枝桿菌雙重感染、結(jié)核耐藥的出現(xiàn)，結(jié)核病死灰復(fù)燃，又逐漸成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病之一。目前，全世界約20億人口感染了結(jié)核分枝桿菌(Mycobac teriumtu berculosis，MTB)，每年新發(fā)患者約900萬，死亡人數(shù)高達(dá)300萬。結(jié)核病由感染MTB引起。

2、MTB為兼性胞內(nèi)寄生菌，寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而侵犯人體。抗MTB是以CD4+T細(xì)胞為主的特異性細(xì)胞免疫為主。T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)特異性地識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞遞呈的結(jié)核抗原，發(fā)揮抗MTB免疫作用。
　　 T細(xì)胞按其抗原受體不同可分為兩型，一種稱為αβT細(xì)胞，表達(dá)TCRαβ；另一種稱為γδT細(xì)胞，表達(dá)TCRγδ。在外周血中，αβT細(xì)胞占成熟T細(xì)胞的90％～95％，而γδT細(xì)胞僅占5％～10％。TC

3、Rγ鏈和δ鏈與CD3分子以非共價(jià)連接成TCRγδ-CD3復(fù)合物表達(dá)于γδT細(xì)胞表面。TCR的γ和δ鏈分別由V/J/C及V/D/J/C基因片段重排后編碼，形成γδTCR分子的多樣性，從而產(chǎn)生數(shù)量眾多的特異性抗原受體，識(shí)別不同的抗原。目前，已知人的γ鏈V區(qū)基因片段有15個(gè)(7個(gè)假基因)，5個(gè)J區(qū)基因片段(分為γJ1和γJ2兩組)，2個(gè)C區(qū)基因片段；δ鏈有6個(gè)V區(qū)，3個(gè)D區(qū)，3個(gè)J區(qū)和1個(gè)C區(qū)基因片段。與αβT細(xì)胞相似，γδT細(xì)胞抗原結(jié)合部位

4、有三個(gè)區(qū)即CDR1、CDR2、CDR3，其中起主要作用的是CDR3區(qū)。TCR重排形成多種多樣的CDR3區(qū)，我們通過對CDR3區(qū)譜型分析，可判別T細(xì)胞克隆性增殖。
　　 生物素-親和素系統(tǒng)以生物素和親和素具有獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，偶聯(lián)大分子生物活性物質(zhì)，具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用廣泛的特點(diǎn)。四聚體技術(shù)中利用了這一系統(tǒng)，將生物素化的四個(gè)單體分子與鏈霉親和素結(jié)合形成四聚體，大大增加了免疫反應(yīng)作用位點(diǎn)，提高了檢測效率。

5、　　 人類γδT細(xì)胞通常是Vγ9和Vδ2配對，Vγ9Vδ2T細(xì)胞占外周血γδT細(xì)胞的50％～95％，并且有許多研究發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞在抗MTB免疫中起重要的免疫保護(hù)作用。
　　 本課題的目的：擬以活動(dòng)性結(jié)核胸膜炎患者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者胸水和外周血作為研究對象，從中分離出淋巴細(xì)胞，再針對TCRγ9鏈序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測序，結(jié)果利用DANMAN、DNAstar軟件及網(wǎng)上TCR資源比對，分析活動(dòng)性結(jié)核病患者是

6、否具有特異性γδT細(xì)胞的克隆性增殖，研究TCRγ9基因重排的特點(diǎn)及CDR3區(qū)譜型；建立穩(wěn)定分泌表達(dá)γδTCR的細(xì)胞株。我們更進(jìn)一步的目的是利用這些細(xì)胞株制備結(jié)核特異性γδTCR四聚體，利用其深入研究γδT細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中的作用，為探索和研究其抗MTB作用以及作為結(jié)核診斷試劑、結(jié)核新型疫苗的可能性建立基礎(chǔ)。
　　 研究內(nèi)容和方法：分離活動(dòng)性結(jié)核胸膜炎患者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者胸水(PLF)標(biāo)本和外周血標(biāo)本(PB)、正常人外周血標(biāo)本及

7、肺部腫瘤患者外周血和胸水標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞，提取其總RNA，利用Switch Mechanism At5'-end of Reverse Transcript(SMART)技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄獲得淋巴細(xì)胞總cDNA，并通過LD-PCR合成第二鏈。根據(jù)GeneBank中已有的TCRγ9鏈序列，設(shè)計(jì)三對引物分別擴(kuò)增TCRγ9鏈的V區(qū)、CDR3區(qū)及C區(qū)。其中V區(qū)的上游引物包括TCRγ9鏈先導(dǎo)序列起始密碼，下游引物根據(jù)V區(qū)相對保守序列設(shè)計(jì)；CDR3區(qū)的上游

8、引物根據(jù)V區(qū)的相對保守序列設(shè)計(jì)，下游引物根據(jù)C區(qū)保守序列設(shè)計(jì)；C區(qū)的上下游引物根據(jù)C區(qū)保守序列設(shè)計(jì)，并且下游引物包括終止密碼。同時(shí)，在V區(qū)上游引物、C區(qū)下游引物5'端分別引入兩種酶切位點(diǎn)。得到的三段擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEM-Teasy載體，經(jīng)過藍(lán)白篩選得到陽性克隆，委托公司測序。測序結(jié)果利用DNAMAN軟件及網(wǎng)上TCR基因資源進(jìn)行分析、比對，研究TCRγ9鏈的CDR3區(qū)譜型，得到不同的TCRγ9基因序列。另外，通過與正常人外周血標(biāo)本和肺部

9、腫瘤患者外周血及胸水標(biāo)本中擴(kuò)增到的TCRγ9鏈的CDR3區(qū)序列比對，篩選結(jié)核特異性TCRγ9基因。通過OverlapPCR將TCRγ9鏈的V區(qū)、CDR3區(qū)、C區(qū)重疊成完整的TCRγ9全長編碼序列，將得到的不同TCRγ9基因去除跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)編碼序列并且在C端連入極性性氨基酸編碼序列和生物素化酶底物基因，克隆入載體pMT/V5/HisB構(gòu)建分泌表達(dá)載體，再與TCRδ2鏈重組分泌表達(dá)載體、BirA重組表達(dá)載體及潮霉素篩選質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)

10、胞后以生物素化的異二聚體的形式分泌表達(dá)，篩選恒定細(xì)胞株；以Dotblotting、SDS-PAGE、Westernblotting等技術(shù)初步鑒定表達(dá)效果。
　　 研究結(jié)果：
　　 本課題分別對12例活動(dòng)性結(jié)核患者胸水標(biāo)本和9例活動(dòng)性結(jié)核患者(包括結(jié)核性胸膜炎或肺結(jié)核)外周血標(biāo)本進(jìn)行了完整的TCRγ9鏈編碼序列的擴(kuò)增。標(biāo)本統(tǒng)一編號(hào)為1～18，其中1、2、3號(hào)標(biāo)本同時(shí)包含胸水及外周血標(biāo)本；4～12號(hào)標(biāo)本單獨(dú)為胸水標(biāo)本；13～

11、18號(hào)標(biāo)本僅為外周血標(biāo)本。共擴(kuò)增克隆得到不同的TCRγ9基因16個(gè)。同時(shí)，從5例正常人外周血標(biāo)本(編號(hào)為C1～C5)和1例肺部腫瘤患者的胸水及外周血標(biāo)本(編號(hào)為Tp和Tb)中擴(kuò)增TCRγ9基因作為對照。正常人對照組共得到2個(gè)不同的TCRγ9鏈序列，肺部腫瘤患者對照組得到2個(gè)TCRγ9鏈序列。
　　 將所得序列與網(wǎng)上TCR資源比對分析后，發(fā)現(xiàn)TCRγ9鏈的V區(qū)全部是GV9*01，而J區(qū)則以JP*01為主，個(gè)別標(biāo)本出現(xiàn)JP*02a，

12、J1*02或J2*01。并且，在大部分TCRγ9鏈基因的V區(qū)與J區(qū)之間有N片段插入或者N、P片段共同插入。對TCRγ9鏈CDR3區(qū)氨基酸序列分析顯示：在同一個(gè)患者胸水和外周血標(biāo)本中擴(kuò)增得到一些相同CDR3區(qū)序列，如1、2、3號(hào)標(biāo)本胸水和外周血標(biāo)本中都有CDR3區(qū)氨基酸序列“ALWGTLQELGKKIKV”。此外，雖然同一病例及不同病例之間CDR3區(qū)呈現(xiàn)多樣性，但是不同病例之間也發(fā)現(xiàn)有一些相同或相似的氨基酸序列，如4、5、6、7、9、10

13、、11、12、14、18號(hào)標(biāo)本有相同CDR3區(qū)氨基酸序列“ALWEVQELGKKIKV”；1、2、3、8、9、10、12、13、17號(hào)標(biāo)本有相同CDR3區(qū)氨基酸序列“ALWGTLQELGKKIKV”等。除此，我們還發(fā)現(xiàn)在不同克隆中存在相同氨基酸基序“ALWE…ELGKKIKV”。進(jìn)一步分析比較發(fā)現(xiàn)“ALWEVQELGKKIKV”僅出現(xiàn)在多個(gè)結(jié)核患者標(biāo)本中。從正常人和肺部腫瘤患者標(biāo)本中分別獲得的2個(gè)TCRγ9鏈CDR3區(qū)基因與結(jié)核患者標(biāo)本

14、中序列相同。“ALWEVIGELGKKIKV”、“ALWGTLQELGKKIKV”和“ALWEVLELGKKIKV”這三個(gè)序列分別在結(jié)核患者與正常人，結(jié)核患者與肺部腫瘤患者，或結(jié)核患者與正常人、肺部腫瘤患者標(biāo)本中出現(xiàn)。
　　 構(gòu)建了4個(gè)TCRγ9鏈pMT重組分泌表達(dá)載體，分別與適合的TCRδ2鏈pMT重組分泌表達(dá)載體配對，與BirA質(zhì)粒、潮霉素篩選質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞。獲得1株穩(wěn)定分泌表達(dá)Vγ9Vδ2TCR單體的細(xì)胞株。

15、>　　 結(jié)論：
　　 1.研究中采用SMART和LD-PCR的技術(shù)方法克服樣本量小的問題，利于對一份樣本進(jìn)行多個(gè)方面的研究。
　　 2.設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增TCRγ9鏈的V區(qū)、CDR3區(qū)及C區(qū)，并采用OverlapPCR方法將三者拼接為TCRγ9鏈全長編碼序列，克服了γδTCR基因擴(kuò)增的困難。
　　 3.CDR3區(qū)譜型分析提示：結(jié)核患者存在γδT細(xì)胞的克隆性增殖?？寺≡鲋车摩忙腡CRCDR3區(qū)氨基酸序列呈現(xiàn)多樣性的

16、特點(diǎn)，但是在同一病例及不同病例之間找到一些相同、結(jié)核患者獨(dú)有的CDR3區(qū)氨基酸序列或者出現(xiàn)頻率較高的氨基酸基序。推測具有這些相同、獨(dú)有的CDR3區(qū)氨基酸序列的γδT細(xì)胞可能與MTB特異性抗原的識(shí)別有關(guān)，而在結(jié)核患者與正常人、肺部腫瘤患者標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的具有相同CDR3區(qū)氨基酸序列的γδT細(xì)胞則可能與共有抗原的識(shí)別及參與早期抗結(jié)核非特異性免疫等有關(guān)。
　　 4.構(gòu)建了4個(gè)TCRγ9基因重組分泌表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定分泌表達(dá)Vγ9Vδ2TC