豬附紅細(xì)胞體基因組文庫(kù)的初步構(gòu)建及特異性基因的篩選應(yīng)用.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoon)是由豬附紅細(xì)胞體寄生于豬紅細(xì)胞的表面、血漿及骨髓內(nèi)，以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床特征的人畜共患傳染病。目前對(duì)該病的研究尚不深入，可供研究的基因片段少，極大的制約了附紅細(xì)胞體病的研究進(jìn)展。
　　為篩選出豬附紅細(xì)胞體特異性基因，本試驗(yàn)初步構(gòu)建豬附紅細(xì)胞體基因組DNA文庫(kù)，以期為附紅細(xì)胞體病深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　以分離的豬附紅細(xì)胞體為試驗(yàn)材料，提取基因組DNA，選擇限制性核酸內(nèi)切酶S

2、au3A I切割DNA，根據(jù)少量酶切的結(jié)果確定最適酶切條件，回收500～2000 bp的DNA片段，與經(jīng)BamH I完全酶切、堿性磷酸酶（CIAP）處理后的pUC18載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp＋抗性及藍(lán)白斑法篩選重組質(zhì)粒，初步構(gòu)建豬附紅細(xì)胞體基因組文庫(kù)。結(jié)果表明，經(jīng)篩選Sau3A I的最適酶切濃度為0.063U/μg DNA，不完全酶切的最適反應(yīng)時(shí)間為30 min。構(gòu)建的豬附紅細(xì)胞體基因組文庫(kù)容量含1.2×10

3、4個(gè)重組體數(shù)，覆蓋率約為豬附紅細(xì)胞體基因組的3倍。
　　隨機(jī)提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，經(jīng)大量測(cè)序初步獲得1個(gè)新基因片段，序列總長(zhǎng)度為825 bp，暫命名為“E.suis-JL1”，該序列最長(zhǎng)ORF識(shí)別大小為243 bp，編碼81個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分析該蛋白的抗原指數(shù)較高。
　　根據(jù)E.suis-JL1序列設(shè)計(jì)引物，建立PCR診斷方法。對(duì)該方法的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行了篩選，并盡興了特異性、敏感性