水稻Bel基因異源表達(dá)特性分析及基因打靶載體構(gòu)建.pdf

1、水稻Bel基因編碼的細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP81A6對(duì)除草劑苯達(dá)松具有抗性作用,對(duì)該P(yáng)450基因進(jìn)一步深入地研究為將其應(yīng)用于提高農(nóng)作物的抗除草劑性能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)采用基因打靶技術(shù)對(duì)水稻.Bel基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除,能有效地獲得苯達(dá)松敏感致死株。本研究將水稻Bel基因轉(zhuǎn)入煙草和番茄基因組中進(jìn)行表達(dá),對(duì)不同抗性的轉(zhuǎn)基因植株從表型和RNA水平進(jìn)行分析,同時(shí)構(gòu)建了對(duì)Bel基因進(jìn)行打靶的載體plNA134-Phpt。主要結(jié)果如下:
　　

2、 1.將實(shí)驗(yàn)室己有的Bel基因表達(dá)載體pKYL71-Bel轉(zhuǎn)化入煙草和番茄基因組并進(jìn)行表達(dá)。對(duì)70株Kan抗性轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR擴(kuò)增,54株檢測(cè)為陽(yáng)性,轉(zhuǎn)化效率為77％；對(duì)50株Kan抗性轉(zhuǎn)基因番茄DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,37株檢測(cè)為陽(yáng)性,轉(zhuǎn)化效率為74％。
　　 2.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和番茄進(jìn)行苯達(dá)松葉盤(pán)篩選和成株檢測(cè),編號(hào)為1號(hào)和13號(hào)的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)濃度為0.25％苯達(dá)松具有抗性。編號(hào)為3號(hào)、23號(hào)和29號(hào)的轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)濃度為0

3、.05％苯達(dá)松具有抗性。
　　 3.以β-actin為內(nèi)參,利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明不同苯達(dá)松抗性的轉(zhuǎn)基因植株在mRNA表達(dá)水平上也存在相應(yīng)表達(dá)量的變化。
　　 4.對(duì)水稻品種C418愈傷誘導(dǎo)及外植體分化的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明當(dāng)2,4-D為3 mg/L,酵母粉為6 g/L,水解酪蛋白為0.6 g/L時(shí)C418的綜合培養(yǎng)能力系數(shù)最高。其中,2,4-D對(duì)水稻愈傷培養(yǎng)性狀影響顯著(P<0.