PRDM16C2C12細胞分化的影響及其PR結(jié)構(gòu)域的功能分析.pdf

1、成肌細胞具有多種分化潛能，除了可以定向分化為肌纖維外，還可以被誘導進入成脂分化。成肌細胞進行成脂分化，在肌肉組織中異位沉積脂肪形成肌內(nèi)脂肪，通常與機體代謝紊亂綜合癥的發(fā)生有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)具有棕色脂肪代謝活性的細胞零散分布于肌內(nèi)脂肪中，其數(shù)量與機體的抗肥胖能力顯著相關(guān)。因此研究成肌細胞向棕色脂肪細胞分化的分子機理對機體健康具有積極意義。
　　 棕色脂肪特異性因子PRDM16((P)ositive(R)egulatory(D)o

2、mainzinc finger protein(1)(6))，又稱PRDI-BF1-RIZ1((P)ositive(R)egulatory(D)omain(I)-(B)inding(F)actor(1) and(R)etinoblastoma-(I)nteracting(Z)inc finger factor-(1))通常被認為是決定肌肉和棕色脂肪細胞共同的前體細胞（中胚層Myf5+/+前體細胞）肌肉/棕色脂肪細胞分化的“開關(guān)”。異位表

3、達PRDM16的成肌細胞成肌分化受到抑制，在生脂培養(yǎng)基中可以被誘導分化為棕色脂肪細胞，但目前PRDM16抑制成肌分化，促進棕色脂肪分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不明了。
　　 1 PRDM16對生肌/生脂因子轉(zhuǎn)錄及其啟動子/增強子DNA甲基化的影響
　　 DNA甲基化是細胞分化過程中調(diào)控組織特異性基因轉(zhuǎn)錄的重要機制之一，因此本實驗通過攜帶Flag-PRDM16的鼠干細胞病毒（(M)urine(S)tem(C)ell(V)irus，

4、MSCV）轉(zhuǎn)導增殖期的C2C12成肌細胞，抗性篩選穩(wěn)定克隆，通過SEQUENOM檢測了肌肉特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋（(b)asic(H)elix-(L)oop-(H)elix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族生肌調(diào)節(jié)因子（(M)yogenic(R)egulatory(F)actors，(M)RFs）和生脂因子過氧化物酶體增殖激活受體γ（(P)eroxisome(P)roliferator(A)ctivating(R)eceptor-(γ)，PPA

5、Rγ）啟動子和/或增強子區(qū)域DNA甲基化程度的改變。
　　 結(jié)果表明，穩(wěn)定表達PRDM16對C2C12成肌細胞的增殖能力沒有顯著影響，顯著降低了C2C12分化為肌管的能力，表現(xiàn)為在生肌培養(yǎng)基（含2％馬血清）中孵育4天，肌管的標志分子肌球蛋白重鏈（(M)yosin(H)eavy(C)hain，MyHC）、肌肉型肌酸激酶((M)uscle-type(C)reatine(K)inase, MCK)以及MRFs(MyoD, Myf5,

6、myogenin, MRF4)mRNA的表達量顯著降低(P＜0.05)，表明轉(zhuǎn)導的外源PRDM16是具有生物功能的，有效抑制了C2C12細胞的成肌分化。
　　 為了避免生肌/生脂培養(yǎng)基對生肌/生脂因子轉(zhuǎn)錄的干擾，我們采用自然分化培養(yǎng)基（即正常的生長培養(yǎng)基，含10％ FBS）誘導細胞分化。4天后，穩(wěn)定表達PRDM16的C2C12細胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）的沉積升高了近一倍(P＜0.05)，同時生脂因子PPAR

7、γ、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白-α((C)CAAT/(E)nhancer(B)inding(P)rotein-(α)，C/EBPα)的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P＜0.05)。PRDM16同樣降低了自然分化條件下C2C12融合成肌管的能力，生肌因子MRFs及MyHC的表達顯著下降(P＜0.05)。結(jié)果表明PRDM16抑制C2C12細胞成肌分化，促進成脂分化，并且PRDM16改變C2C12的分化方向主要是通過改變生肌/生脂因子的轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)的。<

8、br>　　 在未分化的C2C12成肌細胞中，PRDM16顯著降低了除MyoD以外的其他生肌因子的轉(zhuǎn)錄水平，PPARγ mRNA的表達顯著升高(P＜0.05)，提示PRDM16削弱了C2C12向肌纖維分化的潛力，增強了其向脂肪分化的潛能，使C2C12成肌細胞具有了“棕色前體細胞”的某些潛質(zhì)。對基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，通過SEQUENOM檢測以上生肌因子及PPARγ啟動子和/或增強子區(qū)域的脫氧核糖核酸（(d)eoxyribo(n)u

9、cleic(a)cid，DNA）甲基化水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導PRDM16顯著增高了MyoD核心增強子、第一外顯子區(qū)域以及myogenin啟動子DNA的甲基化程度，降低了Myf5最小啟動子區(qū)域部分CpG位點的甲基化水平。而MRF4、PPARγ啟動子DNA甲基化沒有顯著改變。
　　 2 PR結(jié)構(gòu)域缺失對PRDM16生物功能的影響
　　 PR結(jié)構(gòu)域（(P)ositive(R)egulatory domain）是PRDM蛋白家族的特

10、征性結(jié)構(gòu)之一，PR結(jié)構(gòu)域?qū)RDM16調(diào)控生肌/生脂因子轉(zhuǎn)錄的影響目前尚未見報道。為了分析PR結(jié)構(gòu)域的功能，我們進一步構(gòu)建了PR結(jié)構(gòu)域缺失（PRDM16-ΔPR）的質(zhì)粒，篩選穩(wěn)定克隆，研究PR結(jié)構(gòu)域缺失對PRDM16生物功能的影響。
　　 與野生型PRDM16相比，PRDM16-ΔPR削弱C2C12生肌能力的作用更加明顯，表現(xiàn)為肌纖維標志性分子MyHC、MCK的表達顯著下降(P＜0.05)，同時MyoD的表達顯著下降(P＜0.0

11、5)。PRDM16-ΔPR顯著削弱了PRDM16升高細胞內(nèi)TG以及激活PPARγ轉(zhuǎn)錄的作用(P＜0.05)。MyoD和PPARγ轉(zhuǎn)錄被PRDM16-ΔPR抑制，伴隨啟動子區(qū)域組蛋白修飾的改變。染色質(zhì)免疫沉淀分析（(C)hromatin(I)mmunoprecipitation，ChIP）顯示，PRDM16-ΔPR顯著升高了MyoD的啟動子區(qū)域H3乙?；3K9me3和H3K27me3的富集程度(P＜0.05);PRDM16-ΔPR顯著