vriB12基因缺失馬耳他型布氏桿菌M5-90疫苗株的研究.pdf

1、布氏桿菌病是五種世界范圍內(nèi)由細(xì)菌引起的傳染性人獸共患疾病之一,布氏桿菌為革蘭氏陰性,無(wú)芽孢,兼性厭氧的胞內(nèi)寄生菌,分為7個(gè)種:Brucella melitensis(羊種),Brucella suis(豬種),Brucella abortus(牛種),Brucella ovis(綿羊種),Brucella canis(犬種),Brucella neotomae(沙田鼠種),以及Brucella maris(海洋種)。造成公共衛(wèi)生危害的主

2、要是羊種、牛種和豬種布氏桿菌,其中以羊種危害最為嚴(yán)重。
　　 血清學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)動(dòng)物布氏桿菌病的防控和凈化具有極為重要的意義。我國(guó)目前應(yīng)用的布氏桿菌疫苗株包括羊種的M5-90,牛種的A19和豬種的S2。這三種疫苗都存在著疫苗免疫反應(yīng)與自然感染無(wú)法區(qū)別的問(wèn)題,對(duì)布病防控帶來(lái)極大的困擾,迫切需要研發(fā)新型標(biāo)記疫苗。
　　 virB12基因是布氏桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的編碼基因之一,而Ⅳ型分泌系統(tǒng)已被證明是布氏桿菌主要的毒力因子,有研究表

3、明VirB12蛋白位于布氏桿菌細(xì)胞表面,并可能在侵染宿主細(xì)胞時(shí)起重要作用。相關(guān)研究表明VirB12蛋白能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體,是具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的布氏桿菌病血清學(xué)診斷靶抗原。M5-90疫苗株是將羊種M5疫苗株在雞成纖維細(xì)胞上傳代90次之后而得到的毒力減弱的疫苗株,在我國(guó)得到廣泛應(yīng)用于牛羊的布氏桿菌病防控,其安全性和有效性已經(jīng)為實(shí)踐證明。對(duì)M5-90疫苗株的virB12基因進(jìn)行人工缺失,有望獲得能夠鑒別自然感染和疫苗免疫反應(yīng)的標(biāo)記疫苗。

4、
　　 為此,本研究首先利用大腸桿菌重組表達(dá)了VirB12蛋白,作為檢測(cè)抗原,建立了檢測(cè)相應(yīng)抗原的間接ELISA方法。利用該方法檢測(cè)了60份布氏桿菌陽(yáng)性山羊血清及30份布氏桿菌陰性山羊血清,檢出符合率為91.7％,證明重組VirB12蛋白對(duì)山羊布氏桿菌病的檢測(cè)具有良好的特異性和敏感性。
　　 進(jìn)一步采用基因組同源重組方法,構(gòu)建了virB12基因缺失的M5-90疫苗株(M5-90-virB12)。BALB／c小鼠的毒力殘留

5、試驗(yàn)結(jié)果顯示,M5-90-virB12與M5-90免疫小鼠的脾臟重量與荷菌量的消減趨勢(shì)基本吻合,表明M5-90-virB12與M5-90的生物安全性沒(méi)有顯著差別。BALB／c小鼠進(jìn)行的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,攻毒后M5-90-virB12和M5-90免疫鼠之間的脾臟重量及荷菌量均無(wú)顯著差異,且與對(duì)照組差異顯著。同時(shí)在一個(gè)月之內(nèi)監(jiān)測(cè)了M5-90以及M5-90-virB12誘導(dǎo)羊產(chǎn)生的抗體水平,兩者無(wú)明顯差異。說(shuō)明缺失株M5-90-virB1