鴨疫里氏桿菌sprA基因缺失突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是引起雛鴨、鵝、火雞和其它禽類感染全身性漿膜炎的病原體，由于它血清型眾多、各血清型之間的交叉保護(hù)率低以及對抗菌藥物的耐藥性，使得鴨疫里氏桿菌病的防控難度日益增大，該病已成為嚴(yán)重危害全球水禽業(yè)的細(xì)菌性疾病之一。蛋白分泌系統(tǒng)和病原菌的致病性是密不可分的，致病菌通過蛋白分泌系統(tǒng)分泌胞外酶、蛋白酶、毒力因子等破壞宿主細(xì)胞，引起病理損傷和組織壞死。Por分泌系統(tǒng)(Por pro

2、tein secretion system，PorSS)，又被稱為Ⅸ型分泌系統(tǒng)(T9SS)，目前發(fā)現(xiàn)僅分布于擬桿菌門成員中，介導(dǎo)擬桿菌門細(xì)菌的運動性、蛋白分泌及致病機(jī)制。本實驗室已完成鴨疫里氏桿菌血清1型云夢分離株(RA-YM)的基因組測序，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因組存在完整的編碼PorSS的基因。因此，本研究針對RA-YM的PorSS系統(tǒng)SprA基因進(jìn)行缺失，并開展對缺失株ΔsprA其生物學(xué)特性和致病性的研究;同時提取野生株RA-

3、YM和缺失株ΔsprA的外膜蛋白，利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tags，TMT)相對定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析RA-YM和ΔsprA差異外膜蛋白，發(fā)掘通過PorSS分泌的外膜蛋白，明確PorSS分泌到外膜的蛋白與鴨疫里氏桿菌致病性的關(guān)系。本研究取得的結(jié)果如下:
　　1.鴨疫里氏桿菌sprA基因缺失突變株的構(gòu)建與生物學(xué)特性研究
　　擴(kuò)增出sprA基因的左、右同源臂(L、R)和壯觀霉素抗性基因(S)，利用overlap

4、PCR的方法將L、S、R融合，構(gòu)建抗性基因表達(dá)盒LSR，將LSR連至pRE112，構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pRE-LSR。將重組自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli X7213中，挑取陽性克隆，以含有pRE-LSR的E.coli X7213為供體菌，RA-YM為受體菌，進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移試驗，在含壯觀霉素的平板上挑選陽性菌落并利用雙重PCR鑒定缺失株。得到缺失株后在含壯觀霉素的TSA平板上盲傳5代評價其遺傳穩(wěn)定性。同時研究了ΔsprA與RA-YM的生長特性

5、和生化特性，結(jié)果顯示在對數(shù)早期ΔsprA在TSB生長速度快于野生株RA-YM(P＜0.05)，后期生長速度沒有顯著性差異;ΔsprA與野生株RA-YM的基本生化特性基本一致，都不發(fā)酵糖類，可以利用尿素，野生株RA-YM可以液化明膠，ΔsprA不能液化明膠。在12.5％鴨血清中缺失株ΔsprA的存活率顯著低于同等條件下野生株RA-YM的存活率(P＜0.01)。
　　2.RA-YM株與ΔsprA對雛鴨致病性的研究
　　對13日齡

6、的櫻桃谷肉鴨進(jìn)行感染試驗，感染途徑腿部肌肉注射，結(jié)果顯示野生株RA-YM的LDs0為7.21×104CFU，缺失突變株ΔsprA的LD50為3.61×107CFU，與RA-YM相比，ΔsprA的毒力下降了約501倍。比較野生株和缺失突變株的載菌量，結(jié)果表明在感染24h后，ΔsprA在血液和脾臟組織中的載菌量低于RA-YM(P＜0.05);在感染48h后，ΔsprA在血液、肝臟、脾臟和腦組織中的載菌量低于RA-YM(P＜0.05)。組織剖

7、檢和病理切片觀察結(jié)果也表明，心臟、肝臟、脾臟和腦的病變程度，缺失突變株ΔsprA較野生株RA-YM輕微。
　　3.RA-YM株與ΔsprA的明膠酶譜試驗及LC-MS/MS測序分析
　　生化試驗結(jié)果顯示野生株RA-YM能液化明膠，缺失突變株ΔsprA不能液化明膠;明膠酶譜試驗結(jié)果顯示，野生株RA-YM和缺失株ΔsprA存在三條差異性條帶，經(jīng)蛋白質(zhì)測序及生物信息學(xué)分析，獲得7個通過PorSS分泌的蛋白，其中絲氨酸S8家族蛋白酶R

8、AYM_04099、RAYM_01812和帶有金屬磷酸酶保守結(jié)構(gòu)域RAYM_03382可能是導(dǎo)致明膠液化、毒力下降的原因。
　　4.鴨疫病里氏桿菌外膜蛋白串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽相對定量蛋白組學(xué)(TMT)分析
　　使用Na2CO3法提取了野生株RA-YM和缺失突變株ΔsprA的外膜蛋白，利用TMT分析外膜蛋白差異。蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果顯示，一共鑒定到1387個蛋白，213個外膜蛋白，差異表達(dá)外膜蛋白共有65個，其中上調(diào)蛋白43個，下調(diào)蛋白