支氣管敗血波氏桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)hcp基因缺失株的構(gòu)建.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是存在于豬呼吸道中一種重要的革蘭氏陰性病原菌，可引起豬肺炎和豬萎縮性鼻炎(Atrophic rhinitis，AR)。該菌是豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)的重要致病因子之一，且易與其它多種病原微生物發(fā)生混合感染，增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和復(fù)雜程度，從而給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。
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2、型分泌系統(tǒng)(TypeⅥsecretion system，T6SS)是存在于大多數(shù)動(dòng)物革蘭氏陰性細(xì)菌中的一種蛋白分泌系統(tǒng)，是一個(gè)固定于胞質(zhì)中且跨越內(nèi)膜、周質(zhì)、外膜的管狀結(jié)構(gòu)復(fù)合體，結(jié)構(gòu)上類似于可收縮的噬菌體尾部。T6SS激活后可轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的效應(yīng)因子到靶細(xì)胞內(nèi)，與許多致病菌中與致病性相關(guān)。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白（Hemolysin-coregulated protein，Hcp）是T6SS復(fù)合體中重要的管道結(jié)構(gòu)蛋白，也可作為效應(yīng)蛋白發(fā)揮一定的生物學(xué)

3、效應(yīng)，是功能性T6SS的標(biāo)識(shí)。
　　以實(shí)驗(yàn)室分離的支氣管敗血波氏桿菌QH0814菌株作為親本株，使用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的兩步單交換同源重組的方法，構(gòu)建hcp基因缺失株QH0814⊿hcp，對(duì)其基本的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.支氣管敗血波氏桿菌hcp基因缺失株QH0814⊿hcp的構(gòu)建
　　以QH0814為模板擴(kuò)增hcp基因上下游同源臂，串聯(lián)構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pRE-⊿hcp，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移將重組自殺性質(zhì)

4、粒導(dǎo)入親本菌中，利用氯霉素(Cm)抗性基因進(jìn)行篩選獲得單交換接合子，隨后繼續(xù)在無(wú)抗性的TSB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，促進(jìn)無(wú)抗性同源重組的發(fā)生，使用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，缺失株只能擴(kuò)增到500bp片段，并對(duì)此片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證正確，即獲到hcp基因缺失株QH0814⊿hcp。
　　2.支氣管敗血波氏桿菌hcp基因缺失株QH0814⊿hcp生長(zhǎng)特性
　　對(duì)缺失株連續(xù)培養(yǎng)50代，使用PCR鑒定缺失片段處未發(fā)生回復(fù)突變，說(shuō)明該基因缺失后具有一

5、定的遺傳穩(wěn)定性。挑取缺失株和親本株的單菌落，分別接種于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再以1∶1000的比例轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)程中每2h取樣檢測(cè)菌液OD600值繪制生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)親本株與缺失株的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，表明在體外培養(yǎng)條件下，hcp基因的缺失對(duì)菌體體外生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　3.Hcp多克隆抗體的制備及鑒定
　　以QH0814為模板擴(kuò)增hcp基因全長(zhǎng)，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-hcp，轉(zhuǎn)化于BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并使用SD

6、S-PAGE檢測(cè)，表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在，溶解包涵體并進(jìn)行純化，獲得目的蛋白。將所得的蛋白作為免疫蛋白，免疫5周齡的小鼠，免疫完成后采血清進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，確定所制備的血清具有反應(yīng)性和特異性。
　　4.支氣管敗血波氏桿菌hcp基因缺失株QH0814⊿hcp致病性的研究
　　將親本株與缺失株分別以105、106、107、108的劑量腹腔接種于對(duì)5周齡的昆明鼠，記錄死亡情況并計(jì)算LD50的值。結(jié)果顯示，與親本

7、株QH0814比較，缺失株QH0814⊿hcp的毒力降低了約2倍。以106 CFU的劑量腹腔接種5周齡的昆明鼠對(duì)血液中的菌量及肺臟和肝臟載菌量進(jìn)行計(jì)算比較。結(jié)果顯示，與親本株相比，QH0814⊿hcp在血液中菌量降低了5倍，肺臟的載菌量降低了7倍，肝臟的載菌量降低了4倍。hcp基因缺失后，血液中的菌量和組織中的載菌量均顯著下降，且肺臟下降幅度最大，推測(cè)hcp基因與菌體在機(jī)體內(nèi)定植有一定的關(guān)系。
　　使用小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.