重組馬耳他布魯菌OMP31蛋白用于間接ELISA診斷抗原的研究.pdf

1、本研究是對馬耳他布魯菌omp31基因進行原核表達，并建立了以重組OMP31蛋白，作為間接ELISA方法的檢測抗原，檢測陽性血清中因感染牛種布魯菌而致病的血清。主要研究結(jié)果如下：
　　1.布魯菌omp31的原核表達與抗原性檢測
　　采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)從內(nèi)蒙古分離的馬耳他布魯菌擴增得到布魯菌omp31基因片段并插入 PMD18-T載體克隆測序,將目的基因插入原核表達載體pET-30a中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）

2、中進行表達,用SDS-PAGE和western-blot檢測該蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-omp31并在大腸桿菌中，成功表達了omp31基因,重組蛋白能與馬耳他布魯菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　2.間接ELISA法檢測牛種布魯菌病的建立及應(yīng)用
　　以重組OMP31蛋白作為包被抗原，篩選確定了間接ELISA檢測方法的最佳反應(yīng)條件。重組OMP31蛋白最佳抗原包被濃度為2.5μg/ml(稀釋800倍);血清的稀釋

3、度為100倍;封閉液為1％BSA，于37℃封閉2h;酶標二抗反應(yīng)條件為1:5000倍稀釋;OMP31蛋白包被孔的陰、陽性臨界值為0.337。特異性結(jié)果顯示，OMP31蛋白包被孔與免疫 S19疫苗的牛、羊陽性血清和標準牛、羊陰性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。ELISA的重復(fù)性實驗重組OMP31蛋白包被孔的批內(nèi)與批間檢測結(jié)果的變異系數(shù)均低于10%。以上結(jié)果顯示，該間接ELISA方法有很好的重復(fù)性，特異性，敏感性，因此可以作為血清學(xué)方法來診斷有牛種布魯