變形斑沙雷氏菌336X生防相關(guān)基因phy的克隆、功能分析及原核表達(dá).pdf

1、變形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)336X菌株能抑制由子囊菌禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomyces graminis var．tritici，Ggt)侵染根部所引起的小麥全蝕病(take—allof wheat)，具有開(kāi)發(fā)成生防制劑的潛力。從分子水平上探索336X的生防機(jī)制，研究生防細(xì)菌與植物之間的相互作用，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 在本研究中，用變形斑沙雷氏菌568菌株基因組中一個(gè)

2、預(yù)測(cè)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物phyF/R，以336X基因組DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)1569bp的完整ORF片段。擴(kuò)增片段用載體pMD—18T克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該片段和568菌株預(yù)測(cè)的4’—phytase同源，同源性指數(shù)為94％，故將該基因命名為phy。保守域序列分析表明，預(yù)測(cè)氨基酸序列和周質(zhì)可溶性結(jié)合蛋白家族Ⅱ(PBP2_NikA_DppA_OppA_like_7)同源，相似性達(dá)15—21％。通過(guò)信號(hào)肽預(yù)測(cè)程序

3、SignalP3．0 Server分析，發(fā)現(xiàn)在N端有一段31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，成熟肽鏈可能在27—28位氨基酸處切開(kāi)。
　　 為了研究phy的功能，將phy片段插入自殺性載體pKAS32，并用卡那霉素抗性片段中斷，構(gòu)建同源雙交換敲除載體pKAS2—phy—km。通過(guò)接合作用將該質(zhì)粒從大腸桿菌(Escherichia coli，E．coli)S17—1導(dǎo)入336X中，PCR檢測(cè)得到3株phy缺陷型突變株。通過(guò)一系列的表型實(shí)驗(yàn)，

4、發(fā)現(xiàn)突變株攝取Ni2+的能力下降，表明phy可能編碼Ni2+運(yùn)輸過(guò)程中的Ni2+結(jié)合蛋白組分。同時(shí)發(fā)現(xiàn)突變株的生防能力下降，對(duì)小麥根部分泌物的應(yīng)答減弱，在小麥根表的定殖數(shù)量減少。這些結(jié)果可能有助于我們分析336X的生防機(jī)制。
　　 為了進(jìn)一步研究phy性質(zhì)，將phy的ORF序列插入pET—30a中構(gòu)建異源表達(dá)載體pET30a—phy，將該載體導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)異丙基—β—D—硫代吡喃半乳糖苷