克氏原螯蝦α-淀粉酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱小龍蝦，在分類學(xué)上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱，是一種重要的淡水養(yǎng)殖蝦品種。在其整個(gè)生命周期中，蛻皮次數(shù)高達(dá)十幾次，且只有經(jīng)過蛻皮才能實(shí)現(xiàn)性成熟。而蛻皮受到多種因素的調(diào)控，其中消化酶類扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯蝦α-淀粉酶基因并分析了蛻皮激素對(duì)α-淀粉酶表達(dá)水平的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有部分序列，設(shè)計(jì)特異性引物克隆出克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF（open readin

2、g frame）cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF長(zhǎng)1545bp,編碼的蛋白質(zhì)含514個(gè)氨基酸殘基，其氨基端19個(gè)疏水性氨基酸殘基為信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白的理論相對(duì)分子量為55.1 kDa,等電點(diǎn)為4.95.通過雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a-amy，轉(zhuǎn)化至 E. coli Rosetta(DE3)，用不同濃度 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和 Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明克氏原螯蝦α

3、-淀粉酶融合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，但是重組蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。用 Ni-NTA親和層析柱對(duì)α-淀粉酶重組蛋白包涵體進(jìn)行純化并免疫制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)其抗體效價(jià)為1:60000。透析法復(fù)性純化后的重組蛋白，DNS法測(cè)定其酶活為1425±28 U/mg。
　　提取克氏原螯蝦肝胰腺、心臟、腸道、胃、肌肉、鰓6個(gè)不同組織的總蛋白和總RNA,通過免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR法分析克氏原螯蝦α-淀粉酶的組織表達(dá)差異