克氏原螯蝦兩種模式識(shí)別受體基因的克隆、重組表達(dá)及功能分析.pdf

1、模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因編碼的一類參與病原識(shí)別的蛋白質(zhì)，它們能夠與微生物表面病原相關(guān)的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系統(tǒng)。本研究首先在甲殼動(dòng)物中建立了RNA干擾技術(shù)，并利用新建立RNA干擾技術(shù)結(jié)合基因原核重組、熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)克氏原螯蝦(Procambarus

2、clarkii)的兩個(gè)模式識(shí)別受體基因脂多糖和β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白基因以及C-型凝集素基因進(jìn)行了研究。 首先，通過體外轉(zhuǎn)錄合成目標(biāo)基因的雙鏈RaNA，將雙鏈RNA注射克氏原螯蝦或凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)個(gè)體，建立了穩(wěn)定RNA干擾技術(shù)，能夠有效沉默目標(biāo)基因的表達(dá)。而且，這種RNA干擾介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)能夠系統(tǒng)性的發(fā)生，至少持續(xù)96小時(shí)，能夠滿足本研究中對(duì)模式識(shí)別受體基因功能鑒定的要求。

3、 隨后，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)從克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中克隆、鑒定了兩個(gè)模式識(shí)別受體基因：脂多糖和β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白基因(命名為PcLGBP)和C-型凝集素基因(命名為PcLEC)。 PcLGBP基因cDNA全序列包含一個(gè)1107bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼369個(gè)氨基酸。在N末端有

4、一個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，表明PcLGBP是一個(gè)分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一個(gè)糖基水解酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)β-1，3-糖苷鍵識(shí)別序列(Phe235-Asp253)以及兩個(gè)細(xì)胞粘附位點(diǎn)(RGD106-108，157-159)和一個(gè)N糖基化位點(diǎn)(NRSI66-69)。在其類葡聚糖酶結(jié)構(gòu)域還包含決定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)PcLGBP與甲殼類動(dòng)物的脂多糖和β-1，3葡聚糖結(jié)合蛋白LGBP(Lipopolysa

5、ccharide and pβ-1，3-glucan binding protein，LGBP)或β-1，3葡聚糖結(jié)合蛋白(β-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，與一些昆蟲的革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于40％。為分析PcLGBP基因的功能，通過半定量RT-PCR方法研究了其在組織中的分布，并用熒光定量PCR技術(shù)分

6、析了其對(duì)細(xì)菌刺激的響應(yīng)，結(jié)果表明PcLGBP基因是肝胰腺特異表達(dá)的基因，能響應(yīng)熱致死鰻弧菌刺激而增強(qiáng)表達(dá)，說明PcLGBP基因可能參與螯蝦的細(xì)菌防御反應(yīng)。 利用酶聯(lián)免疫法對(duì)重組PcLGBP蛋白與細(xì)菌和真菌表面多糖的結(jié)合活性進(jìn)行了鑒定，表明重組PcLGBP蛋白能與來(lái)源于革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖和來(lái)源于真菌的β-1，3-葡聚糖結(jié)合，而對(duì)來(lái)源于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖則沒有結(jié)合活性。為進(jìn)一步了解PcLGBP基因在細(xì)菌防御中的作用，利用

7、RNA干擾技術(shù)沉默PcLGBP基因的表達(dá)，并用三種不同的病原菌進(jìn)行了細(xì)菌侵染實(shí)驗(yàn)。PcLGBP基因沉默顯著降低了克氏原螯蝦對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的防御能力，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌侵染沒有顯著的影響。 PcLEC基因的cDNA全序列包含一個(gè)813bp的ORF，編碼271個(gè)氨基酸，在N末端有一個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，以及一段富含甘基酸的序列，在C末端有一個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CarbohLydrate recognition domain，CR

8、D)。另外還有四個(gè)半胱氨酸殘基，可能參與形成兩對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵。PcLEC同甲殼動(dòng)物、昆蟲等物種的C型凝集素都有明顯的序列相似性。空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，PcLEC與經(jīng)典的半乳糖結(jié)合C-型凝集素具有相似的空間結(jié)構(gòu)，有七個(gè)β折疊，2個(gè)α螺旋共九個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，有兩對(duì)二硫鍵和一個(gè)長(zhǎng)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是一個(gè)經(jīng)典的短型凝集素。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)PcLEC基因的組織表達(dá)和細(xì)菌刺激后的時(shí)序表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。在肌肉、心、肝胰腺、鰓、性腺和血細(xì)胞等六個(gè)組織中均檢

9、測(cè)到PcLEC基因的表達(dá)，其中在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)量最高，而在肌肉、鰓和性腺中的表達(dá)量相對(duì)較低。同時(shí)，熱致死的細(xì)菌注射能顯著增強(qiáng)PcLEC基因的表達(dá)。對(duì)重組PcLEC蛋白進(jìn)行凝菌實(shí)驗(yàn)表明重組PcLEC對(duì)大腸桿菌、鰻弧菌和藤黃微球菌都表現(xiàn)出依賴Ca2+的凝集效應(yīng)，這種凝集效應(yīng)能夠被半乳糖和N-乙酰半乳糖胺抑制。酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了PcLEC對(duì)半乳糖和N-乙酰半乳糖胺具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。 本研究的結(jié)果表明PcLGBP和Pc

10、LEC分別為革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合蛋白和C型凝集素家族的兩個(gè)模式識(shí)別受體。PcLGBP基因是肝胰腺特異表達(dá)的基因，PcLEC基因在肌肉、心、肝胰腺、鰓、性腺和血細(xì)胞中均能表達(dá)，在血細(xì)胞和肝胰腺中表達(dá)量最高。二者均能夠被熱致死的鰻弧菌刺激表達(dá)上調(diào)。PcLGBP蛋白能夠與革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌的表面多糖脂多糖以及β-1，3-葡聚糖結(jié)合，介導(dǎo)克氏原螯蝦革蘭氏陰性細(xì)菌侵染的防御。PcLEC蛋白能夠與半乳糖及其衍生物N-乙酰半乳糖胺結(jié)合，以鈣離子依賴的