PHA基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及功能分析.pdf

1、通過對(duì)表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS—PAGE分析、生物活性與功能分析,確定了基因phaA、phaB和phaC的生物學(xué)功能.結(jié)果表明:1.利用所提取的開放閱讀框架的序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物,采用PCR技術(shù),從合成PHA的亞克隆片段中分離出phaA、phaB和phaC三個(gè)基因片段,經(jīng)凝膠電泳分析表明,所克隆的三個(gè)基因分子量大小與推測的三個(gè)開放閱讀框架中基因片段大小一致.2.將phaA、phaB和phaC片段雙酶切后,定向克隆至原核表達(dá)載體

2、pBV220,構(gòu)建了三個(gè)原核表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C;經(jīng)酶切分析表明,所克隆的三個(gè)基因phaA、phaB和phaC置于表達(dá)載體的正確閱讀框架下.3.利用溫度誘導(dǎo)外源基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后2小時(shí)外源基因開始表達(dá),所表達(dá)蛋白的量隨著時(shí)間的增加而增加,當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)后外源基因表達(dá)的增加量趨于平穩(wěn),確定4小時(shí)為較為合適的誘導(dǎo)時(shí)間.4.表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的蛋白均為可溶性蛋白,沒有

3、包涵體出現(xiàn);蛋白經(jīng)SDS—PAGE分析表明,基因phaA表達(dá)的蛋白分子量為42kDa,與β—酮硫裂解酶分子量大小一致;基因phaB表達(dá)的蛋白分子量為26kDa,與乙酰乙酰CoA還原酶分子量大小一致;基因phaC表達(dá)的蛋白分子量為63kDa,與PHA合成酶分子量大小一致.5.將phaA、phaB和phaC基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物混和后,加入底物乙酰CoA,于230nm—240nm波長下,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)在波長235nm處有明顯的PHA特