25203.產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建姓名：錢(qián)國(guó)良申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：劉鳳權(quán)20091201產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建名為OHllH和OHllB。在LA平板上，野生型OHll產(chǎn)生黃色素，菌落為黃色。色素突變株OHllH可以產(chǎn)生可溶性的黑色素，但其菌落仍為黃色；OHllB茵落形態(tài)為白色，缺失了黃色素的合成。通過(guò)任意PCR和亞克隆技術(shù)，鑒定了轉(zhuǎn)座子在OHll

2、H和OHllB中的插入位點(diǎn)分別為hmgA基因和acp基因。hmgA基因編碼尿黑酸1，2加氧化酶，參與酪氨酸的代謝。而acp基因編碼3羰基(?；d體蛋白)合成酶I，與脂肪酸生物合成(FAS)相關(guān)。在前期以幽謝基因作為報(bào)告基因篩選自殺載體的基礎(chǔ)上，本研究再次以hmgA為報(bào)告基因，驗(yàn)證不同類(lèi)型的自身載體在OHll中完成基因定向敲除的可行性，并再次確認(rèn)在參試的自殺載體中，只有pEXl8GM才能完成靶標(biāo)基因的定向缺失敲除，與前期篩選結(jié)果一致。通過(guò)

3、同源重組技術(shù)，分別構(gòu)建了hmgA和acp的定向敲除突變株，并明確hmgA的突變改變了OHll的細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞從棍棒狀變?yōu)闄E圓狀，但不改變茵落形態(tài)；提高了OHll生物膜形成能力、在水稻葉片上的定殖能力及對(duì)水稻紋枯病的防效，但不改變OHII胞外多糖形成能力、4種胞外酶的產(chǎn)生能力和平板拮抗活性。明確了acp的突變不改變OHll的細(xì)胞形狀，但使細(xì)胞周?chē)岸嗵恰鳖?lèi)物質(zhì)增加，降低了OHll生物膜形成能力，在水稻葉片上的定殖能力及對(duì)水稻紋枯病的防效

4、，同樣不改變OHll胞外多糖形成能力、4種胞外酶的產(chǎn)生能力和平板拮抗活性。此外，還初步明確了可溶性黑色素和茵體自身的黃色素可能與細(xì)茵抵御紫外光損傷無(wú)關(guān)。結(jié)合表型篩選和驗(yàn)證，從OHll的突變株文庫(kù)中篩選到5株胞外多糖(exopolysacchide，EPS)缺失突變株，分別命名為MEPSlMEPS5。在LAS培養(yǎng)基上，野生型OHll菌落黃色、飽滿(mǎn)、光滑，而EPS缺失突變株茵落干燥、皺縮，但菌落仍為黃色。通過(guò)任意PCR技術(shù)(arbitrar

5、yPCR)，快速鑒定了轉(zhuǎn)座子在MESlMES5中的插入位點(diǎn)分別為別是tonB基因、透性酶(permease)編碼基因、IV分泌系統(tǒng)中Pilin蛋白編碼基因，以及未知蛋白編碼基因，表明眾多基因參與了EPS的合成。在任意PCR的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)亞克隆技術(shù)(subcloning)，克隆了tonB的完整基因。通過(guò)同源重組技術(shù)，構(gòu)建了tonB定向缺失突變株，并明確tonB的突變降低了OHll的滑行能力，改變了OHll的茵落形態(tài)，但不改變菌體細(xì)胞

6、形態(tài)；降低了OHll生物膜形成能力、在水稻葉片上的定殖能力及對(duì)水稻紋枯病的防效。初步明確了EPS可能與產(chǎn)酶溶桿菌抵御紫外光損傷相關(guān)。利用大腸桿菌中的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子P切實(shí)現(xiàn)了外源基因即AHL類(lèi)信號(hào)分子降解基因aiiA在產(chǎn)酶溶桿菌OHll中的重組表達(dá)，構(gòu)建了抗生素標(biāo)記的工程菌株OHllA。菌株OHllA能顯著降解不同植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的AHL類(lèi)信號(hào)分子。在離體生防試驗(yàn)中，OHllA能大幅度降低軟腐病菌對(duì)大白菜的致病性，但不抑制軟腐病菌在寄主組