豬早期妊娠診斷膠體金試紙條的研制.pdf

1、孕酮（Progesterone，簡稱P4）是一種甾體類激素，主要由黃體及胎盤產(chǎn)生。雌性動物性周期中孕酮水平呈規(guī)律性變化，發(fā)情期孕酮水平最低，黃體期孕酮水平較高，妊娠期孕酮水平則一直維持在較高水平上。傳統(tǒng)孕酮檢測采用放射免疫方法(RIA)，但鑒于放射性免疫所需設備昂貴，放射物污染環(huán)境，不適宜在生產(chǎn)中推廣。本研究根據(jù)抗原抗體特異性結合原理制備膠體金試紙條，旨在為豬的早期妊娠診斷提供參考，該試紙條不需要專業(yè)人員即可使用，便于在市場推廣。本研究

2、通過孕酮人工抗原的合成和單克隆抗體的制備，組裝了可以用于豬早孕診斷的膠體金試紙條。
　　 1孕酮完全抗原的研制
　　 為了合成孕酮完全抗原，用O-羧甲基羥胺法將孕酮(P4)肟化，制備半抗原孕酮-3-（O-羧甲基）肟，采用薄層色譜法(TLC)和質譜法鑒定半抗原結構;用混合酸酐法合成孕酮的完全抗原孕酮-牛血清白蛋白(P-BSA)，孕酮-雞卵清白蛋白(P-OVA)。用紫外掃描和SDS-PAGE電泳對人工抗原進行初步鑒定，再用免

3、疫學的方法對人工抗原進行最終鑒定。TLC試驗結果顯示孕酮的遷移率為0.4，合成物的遷移率為0.2，初步說明肟化成功，有肟化物產(chǎn)生。質譜圖最強m/z386.2為孕酮-3-（O-羧甲基）肟的分子離子峰，與其理論分子量387.52基本一致，證明孕酮的衍生化是成功的。紫外全波長掃描的結果顯示BSA的最大吸收峰為278nm，而P-BSA的最大吸收峰偏移到255 nm，P-BSA的紫外全波長掃描的波形和BSA相比發(fā)生了明顯的變化;P-OVA的最大吸

4、收峰為255 nm，和OVA最大吸收峰278 nm相比發(fā)生了偏移，P-OVA的波形和OVA相比發(fā)生了明顯的變化。初步證明孕酮人工抗原的合成是成功的。
　　 結合紫外全波長掃描和考馬斯亮藍法估算P-BSA和P-OVA中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比率，測得P-BSA的偶聯(lián)比率為30∶1，P-OVA的偶聯(lián)比率是4∶1。用P-BSA免疫新西蘭大白兔4次后得到孕酮多克隆抗體，建立間接ELISA和間接競爭ELISA法檢測血清抗體效價和抗體競爭抑

5、制率。結果表明，免疫兔血清的效價達到了1∶219，兔血清多克隆抗體競爭抑制率(IC50)為207 ng/mL-間。最終證明該完全抗原可以刺激動物產(chǎn)生針對孕酮的高效價、高特異性的抗血清，半抗原孕酮-3-（O-羧甲基）肟和人工抗原P-BSA，P-OVA合成成功。
　　 2孕酮單克隆抗體的研制
　　 為了制備孕酮的單克隆抗體，用人工合成的孕酮-牛血清白蛋白(P-BSA)作為抗原免疫BALB/C小鼠4次后，取其中一只小鼠的脾細胞

6、，在PEG1450作用下與SP2/0細胞融合，與此同時建立檢測孕酮抗體的間接ELISA方法。利用雜交瘤技術和ELISA方法篩選得到1株穩(wěn)定分泌孕酮單克隆抗體的雜交瘤細胞株2C11。用建立好的間接ELISA方法對其腹水進行效價測定，其效價為1∶204800。對這株單抗進行亞型鑒定，結果顯示其IgG1的OD450值0.481，Kappa的OD450值0.601，其余的亞型OD450值均小于0.2（OD450≥0.2判為陽性），說明雜交瘤細胞

7、2C11分泌的抗體亞型為IgG1，輕鏈類型為Kappa。將這株細胞經(jīng)體外傳代和多次凍存復蘇后，連續(xù)培養(yǎng)5天，其上清OD450均值分別為1.10、1.12、1.11、1.12、1.19，說明2C11抗體分泌穩(wěn)定。
　　 3檢測孕酮的膠體金試紙條的研制
　　 利用2C11雜交瘤細胞株的腹水單抗制備檢測孕酮的膠體金試紙條。采用免疫競爭法，將2C11分泌的單克隆抗體-膠體金復合物包被在膠體金結合墊上，單克隆抗體包被濃度為18μg

8、/mL。同時將人工合成的P-OVA以0.548 mg/mL包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線（T線），將孕酮單克隆抗體的羊抗鼠二抗以0.625 mg/mL包被在硝酸纖維素薄膜表面作為質控線（C線）。T線的人工抗原與待檢樣品中的孕酮競爭結合膠體金標記的孕酮單克隆抗體，通過T線是否顯色判斷陰陽性。采用該試紙條檢測樣品，整個檢測過程只需10 min，檢測限可以達到100 ng/mL，與睪酮，雌二醇無交叉反應。說明檢測試劑具有較高的靈敏度及特異