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
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文檔簡介
1、雞球蟲病是一種危害嚴重的細胞內(nèi)寄生蟲病,對全世界的養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。雞球蟲病的防治主要是依靠化學藥物和活球蟲疫苗的使用(Shirley et al.,2005),然而隨著化學藥物的使用,藥物殘留、抗藥性蟲株的產(chǎn)生以及人們對動物性食品藥物殘留的擔心等諸多問題隨即而生,而開發(fā)新的化學藥物成本又高,同時弱毒球蟲疫苗的應用因具有致病性、生產(chǎn)成本高、可能產(chǎn)生“返祖”的現(xiàn)象等弊端而影響?zhàn)B雞業(yè)生產(chǎn)。隨著生物技術的發(fā)展,新型疫苗的應用研究越來
2、越深入。核酸疫苗具有可靠的安全性,較高的穩(wěn)定性,便于生產(chǎn)和運輸,生產(chǎn)成本低,能誘導機體產(chǎn)生高效的免疫應答等諸多優(yōu)點。柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2(EtMic2)是由球蟲頂復合器微線體分泌的多種蛋白質(zhì)之一,已有研究表明,EtMic2蛋白在雞球蟲入侵時起著重要的作用(Kawazoe et al.,1992)。雞IL-18(ChIL-18)是一種具有多向和多層次免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子,能刺激產(chǎn)生Th1細胞介導的細胞免疫和Th2細胞介導的體液免疫
3、,在宿主防御、抑瘤抗瘤、抗變態(tài)反應等方面具有重要作用,是一種良好的免疫增強劑。本研究將柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2基因(EtMIC2)單獨和與作為免疫增強劑的ChIL-18基因串聯(lián)插入到pVAX1真核表達載體中構建DNA疫苗,并檢測其對Etenella攻蟲的保護作用。試驗具體分為以下幾個部分:
1.ChIL-18蛋白的表達純化及多克隆抗體的制備
將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-IL-18在大腸桿菌中進行原核表達,重組質(zhì)
4、粒經(jīng)IPTG誘導驗證表達后,進行大量表達并用Ni柱進行ChIL-18蛋白的純化。將純化后的ChIL-18蛋白三次免疫BALB/c小鼠進行多克隆抗體的制備。通過間接ELISA方法測定抗ChIL-18抗體的效價后,將采取并分離的血清作為多克隆抗體使用。
2.核酸疫苗重組質(zhì)粒的構建與表達
利用DNA重組技術,分別構建了核酸疫苗pVAX1-MIC2,pVAX1-IL-18和pVAX1-MIC2-IL-18。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定
5、正確后,為了驗證其在體外的表達,將構建的各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,并通過IFA和Western blot方法檢測。為了驗證其在體內(nèi)的表達,將3種DNA疫苗注射到昆明小鼠體內(nèi),通過檢測小鼠血清中EtMic2和ChIL-18特異性抗體的水平驗證其在體內(nèi)表達。
3.重組核酸疫苗的免疫保護性試驗
設立pVAX1-MIC2,pVAX1-IL-18,pVAX1-MIC2-IL-18和pVAX1-MIC2混合pVAX1-IL-1
6、8四個免疫組進行免疫保護試驗,同時設立pVAX1.0空質(zhì)粒免疫組和感染非免疫和非感染非免疫對照組,每組20只雛雞。分別將各重組核酸疫苗以100μg/只的劑量于7、14、21日齡三次經(jīng)腿部肌肉注射免疫雛雞。28日齡時,除非感染非免疫組的雞只外的全部雛雞經(jīng)口感染6000個新鮮的E.tenella孢子化卵囊,感染后一周宰殺全部的試驗動物,一方面從增重、盲腸病變計分、卵囊排出量和抗球蟲指數(shù)等指標進行統(tǒng)計,另一方面進行抗體水平檢測、脾淋巴細胞檢測
7、和細胞因子水平檢測等。
通過兩個方面對構建的DNA疫苗進行保護力大小的評價。結果表明,pVAX1-MIC2,pVAX1-MIC2-IL-18和pVAX1-MIC2混合pVAX1-IL-18免疫組均能增加體重,減輕雞球蟲感染后的盲腸病變和減少卵囊排出量,其中pVAX1-MIC2免疫組的ACI為153,pVAX1-MIC2混合pVAX1-IL-18免疫組的為156,而pVAX1-MIC2-IL-18免疫組的ACI可達171,可見p
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