水稻類受體蛋白激酶OsRPK1激酶域的表達(dá)純化及體外激酶活性驗(yàn)證.pdf

1、本文旨在通過(guò)異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水稻LRR型類受體蛋白激酶OsRPK1激酶域,并在體外進(jìn)行其激酶活性分析,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明其能發(fā)生自體磷酸化反應(yīng)。植物類受體蛋白激酶廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病和抗逆等途徑。類受體蛋白激酶生理作用的發(fā)揮依賴于自身的激酶活性,因此研究該類激酶的活性及發(fā)揮活性的必要因素是開展其功能研究非常重要的方面。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中開展了鹽脅迫下水稻質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析,鑒定了一批鹽脅迫響應(yīng)蛋白,其中包

2、括一個(gè)分子量98kDa,等電點(diǎn)5.93的蛋白點(diǎn),在脅迫處理后表達(dá)水平顯著上調(diào)。經(jīng)水稻蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,該蛋白為一個(gè)推測(cè)的類受體蛋白激酶,我們將其命名為OsRPK1。OsRPK1基因全長(zhǎng)3177bp,編碼區(qū)2910bp,編碼969個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析,推測(cè)OsRPK1是一個(gè)包括亮氨酸富集區(qū)(Leucine-Rich-Repeat,LRR)的類受體蛋白激酶。為了用實(shí)驗(yàn)方法具體驗(yàn)證OsRPK1能否發(fā)生自體磷酸化反應(yīng),我們?cè)O(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn):

3、首先,通過(guò)RT-PCR方法從鹽脅迫的水稻根尖組織cDNA中擴(kuò)增得到OsRPK1(OSRPK1除去預(yù)測(cè)的信號(hào)肽區(qū))和OsRPK1-KD(預(yù)測(cè)的OsRPK1激酶區(qū))基因片段。利用DNA重組技術(shù),將這兩個(gè)片段分別連接到pGEX-4T-1載體上,構(gòu)建了OsRPK1和DsRPK1-KD的原核表達(dá)載體pGEx-OsRPK1和pGEX-OsRPK1-KD。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),SD

4、S—PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。同時(shí),我們從pGEX-OsRPK1-KD載體上擴(kuò)增了GST-OsRPK1—KD片段,并將其連接到pPICZαA載體上,構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPICZαA-GST-OsRPK1-KD,將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母X-33菌株,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。最后,將有表達(dá)的融合蛋白,通過(guò)GST resin親和純化,與γ-32P-ATP反應(yīng),放射自顯影檢測(cè)磷酸化活性。
　　 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),本文成功構(gòu)建了

5、兩個(gè)原核表達(dá)載體和一個(gè)真核表達(dá)載體,其中pGEX-OsRPK1-KD能夠在大腸桿菌BL21菌株表達(dá)GST-OsRPK1-KD融合蛋白。通過(guò)GST resin親和層析,得到純化的GST-OsRPK1-KD融合蛋白。GST-OsRPK1-KD與γ-32P-ATP孵育,在Mn2+或Mg2+或者二者都存在的情況下,表現(xiàn)出蛋白激酶活性,即能夠發(fā)生自體磷酸化,同時(shí)該活性需要細(xì)胞總蛋白的參加。輔助因子二價(jià)陽(yáng)離子,相比Mn2+來(lái)說(shuō),Mg2+更能激活GS