柞蠶蛋白激酶C受體1基因的鑒定與表達分析.pdf

1、分類號：單位代碼：10364密級：學號：12720440安徽農業(yè)大學安徽農業(yè)大學學位論文柞蠶柞蠶蛋白激酶蛋白激酶C受體受體1基因的鑒定與基因的鑒定與表達分析表達分析IdentificationexpressionanalysisofreceptfactivatedCkinase1fromsilkproducinginsectAntheraeapernyi研究生：于皓指導教師：劉朝良教授合作指導教師：朱保建副教授申請學位門類級別：理學碩士

2、專業(yè)名稱：生物化學與分子生物學研究方向：昆蟲生化與分子生物學所在學院：生命科學學院答辯委員會主席：二零一五年六月摘要蛋白激酶C受體l(receptfactivatedCkinase1，RACKl)是WD40家族的成員，它不僅可以做為穩(wěn)定蛋白激酶C(proteinkinasesCPKC)的受體，可以在多個信號轉導通路中起到重要的調控作用。而且還可以通過和其他蛋白相結合，協(xié)同調節(jié)細胞內的各項生理活動。本實驗通過特異性引物的設計，在PCR克隆

3、，測序，獲得柞蠶蛋白激酶C受體1基因的正確讀碼框序列。測得該基因讀碼框全長為960bp，對319個氨基酸進行編碼。對其蛋白分子量預測為35.88kDa。通過構建系統(tǒng)進化樹，柞蠶RACK1氨基酸序列與小菜蛾等鱗翅目昆蟲的同源性較高，普遍在95%以上。將克隆所得目的片段與質粒pET28a表達載體相連接，得重組質粒pET28aRACK1，將其轉化入感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，對蛋白采用不同濃度的IPTG誘導表達。經蛋白電泳和蛋白免疫印跡分

4、析表明，所需目的蛋白得到正確誘導的表達，分子量大小在36kDa左右。重組蛋白進行純化用本實驗室NiNTA親和層析柱。并且用純化的蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體?？贵w效價經ELISA檢測，達到1：20000。提取柞蠶卵、幼蟲，蛹、成蟲四個階段對RACK1進行時序表達分析，結果表明在四個時期均有表達，表達情況不一，成蟲期表達量相對較高，卵期較低。分別提取柞蠶幼蟲五齡第三天的脂肪體，馬氏管，血液，中腸，表皮5個不同組織的總RNA和

5、總蛋白分析柞蠶RACK1在不同組織中的表達情況。實驗結果表明柞蠶RACK1在所取五種組織中均有表達，表達量相對較高在脂肪體和馬氏管中。選取五齡第三天的柞蠶幼蟲，分別注射核型多角體病毒（病毒），白僵菌（真菌），大腸桿菌（細菌）三種病原微生物進行免疫刺激，并提取1.536122448h六個時間點脂肪體和馬氏管的RNA和總蛋白。通過熒光定量和蛋白免疫印跡法分析柞蠶RACK1經過免疫刺激后，在不同的時間點表達量的變化。通過對柞蠶進行病原微生物刺

6、激，RACK1表達量上調且變化情況不一，注射大腸桿菌變化最為明顯，12h后RACK1表達量顯著升高在24h達到最高，但在48h顯著降低，注射白僵菌和NPV相對變化較小，在24h48h有所升高。表明RACK1可能參與到了柞蠶對外源病原微生物的免疫反應中。柞蠶是大蠶蛾科，做為一種重要的經濟絹絲昆蟲，在食品和藥用方面都有經濟價值。對天然柞蠶開展免疫研究，對于提高柞蠶的抗病能力，為保障養(yǎng)蠶業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。關鍵詞：柞蠶，蛋白激酶C