食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文大腸桿菌天然復(fù)合防腐劑研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　大腸桿菌天然復(fù)合防腐劑研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學(xué)與工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p&g

3、t;<p>　　摘要··································

4、;····································

5、83;·····················2</p><p>　　ABSTRACT··········

6、;····································

7、83;···································3</p

8、><p><b>　　1 前言3</b></p><p><b>　　1.1 概述3</b></p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑4</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料4</p><p>　　2.2 主要儀器4</p><p>　　

9、2.3 主要試劑4</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法4</b></p><p><b>　　3.1菌種來源4</b></p><p>　　3.2培養(yǎng)基制備5</p><p>　　3.3 烏梅和魚腥草天然抑菌劑的制備5</p><p><b>　　3

10、.4實(shí)驗(yàn)方法5</b></p><p><b>　　4實(shí)驗(yàn)方案5</b></p><p>　　4.1烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)合抑制大腸桿菌效果研究5</p><p>　　4.2烏梅提取物和魚腥草提取物復(fù)合抑制大腸桿菌的效果研究6</p><p><b>　　5結(jié)果分析6</b>

11、;</p><p>　　5.1烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)合抑制大腸桿菌的效果及分析6</p><p><b>　　6小結(jié)11</b></p><p>　　致謝···············&#

12、183;····································

13、····································

14、3;·18</p><p>　　附錄1······························

15、3;····································&#

16、183;····················19</p><p>　　附錄2···········&#

17、183;····································

18、····································

19、3;···23</p><p>　　[摘要] 食品防腐到目前為止仍然是食品行業(yè)關(guān)注熱點(diǎn)之一，隨著食品安全問題的不斷發(fā)生，化學(xué)防腐劑的食品安全問題日益突出，安全性高、防腐效果好的天然防腐劑成為今后食品保藏的主要研究方向。本文以我國資源保有量大的天然植物為原料，以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)菌種，研究了烏梅和魚腥草對大腸桿菌的抑菌效果研究，分別研究了其對大腸桿菌的最低抑菌濃度等特性，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了復(fù)

20、配，并優(yōu)化了兩種天然防腐劑的最佳配比。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 最低抑菌濃度；大腸桿菌；防腐劑；復(fù)配</p><p>　　Study on the natural compound preservative of E.coli</p><p>　　[Abstract] With the continuous improvement of living sta

21、ndards and growing concern on health, it is the safety of food preservatives put forward higher requirements. This preliminary study of the ebony and Houttuynia antimicrobial effect,the study result showd their minimal i

22、nhibitory concentrations(MIC). On this basis, the two components were mixed, and optimize complex Houttuynia ebony and the best ratio of natural preservatives.</p><p>　　[Key words] MIC;E.coli; Preservative ;

23、Complex;</p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1 概述</b></p><p>　　天然防腐劑是目前食品保藏的研究熱點(diǎn)之一，同化學(xué)防腐劑相比，天然防腐劑具有以下優(yōu)點(diǎn)：如防腐能力強(qiáng)、食品安全性好、溶解度及熱穩(wěn)定性較好。但實(shí)際應(yīng)用中天然防腐劑也有較大的缺點(diǎn)，如抑菌譜較窄，應(yīng)用于

24、食品保藏中如僅采用單一天然防腐劑則抑菌效果較差[1]。為了解決上述問題，在了解不同生物防腐劑抑菌譜的基礎(chǔ)上，利用幾種生物防腐劑抑菌譜交叉后能夠擴(kuò)大抑菌范圍、提高抑菌效果的原理，實(shí)行天然防腐劑的復(fù)配成為今后天然防腐劑應(yīng)用的重要方向。</p><p>　　近年來，我國食品工業(yè)發(fā)展極為迅速，產(chǎn)值逐年提高，到目前為止已成為我國工業(yè)產(chǎn)業(yè)中的龍頭產(chǎn)業(yè)。但到目前為止，食品防腐仍然是我國食品工業(yè)中亟待解決的問題之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)

25、組織有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：全世界每年因食品保藏手段落后而導(dǎo)致的糧食和食品的損失高達(dá)20%。以此計(jì)算，全世界每年由于食品腐敗而導(dǎo)致的損失高達(dá)數(shù)十億美元。食品腐敗不僅會造成食品營養(yǎng)價(jià)值的降低和損失，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致食物中毒。因此，發(fā)展現(xiàn)代保藏技術(shù)、降低由于食品腐敗而導(dǎo)致的損失刻不容緩?？傮w而言，食品腐敗變質(zhì)的原因主要是由于微生物的作用。微生物廣泛存活于環(huán)境中，食品原料如保藏條件不適，很容易發(fā)生腐敗變質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)、碳水化合物含量豐富的肉類食品原料。

26、食品保藏手段的發(fā)明和發(fā)展也是針對這一主要因素，如煙熏、鹽漬、冷凍或干燥等。但就保藏手段的成本和投入而言，使用防腐劑是目前所有食品保藏手段中最為經(jīng)濟(jì)、簡單的方法。目前食品工業(yè)中使用防腐劑是最為常見的方法。所使用的防腐劑按其來源可分為連大類：</p><p>　?。?）化學(xué)防腐劑化學(xué)防腐劑是人工合成的防腐劑，目前食品工業(yè)中常用的化學(xué)防腐劑主要包括苯甲酸及苯甲酸鹽、山梨酸及山梨酸鹽、對羥基苯甲酸及其衍生物等；除上述有機(jī)

27、酸累防腐劑外、無機(jī)化學(xué)防腐劑如二氧化硫、亞硫酸鹽等也是常用的化學(xué)防腐劑?；瘜W(xué)防腐劑在目前食品工業(yè)中應(yīng)用極為廣泛，這主要是由于其生產(chǎn)成本低、溶解度高、應(yīng)用方便。但隨著目前人們對食品安全的日益重視，尤其是近年來食品安全事件屢發(fā)，化學(xué)防腐劑的食品安全性日益受到懷疑，如有資料證明：苯甲酸及苯甲酸鈉可導(dǎo)致豌豆尖細(xì)胞發(fā)生基因突變。盡管這一現(xiàn)象在大鼠等高等動物身上還未證實(shí)，這也為苯甲酸及其鈉鹽等化學(xué)防腐的食品安全性敲響了警鐘。</p>

28、<p>　?。?）天然防腐劑：天然防腐劑是以天然動植物或微生物為原料，從中提取的對微生物具有較強(qiáng)抑制作用的天然物質(zhì)。按其來源可分為動物源、植物源和微生物源三大類。其中動物源和微生物源這兩類天然防腐劑距離實(shí)際應(yīng)用還有相當(dāng)一段路要走。這主要是由于目前動物源天然防腐劑主要來源為各種動物體內(nèi)提取的蛋白肽類物質(zhì)，此類物質(zhì)在動物體內(nèi)本身含量極低，導(dǎo)致提取出來的蛋白肽類天然防腐劑成本極高；而微生物源天然防腐劑目前市場上見到的僅有乳酸鏈球菌素

29、（Nisin）和納他霉素，這兩類微生物源天然防腐劑抑菌譜較窄。我國天然植物資源豐富，諸多天然植物均有較好的抑菌效果。這為植物源天然防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。盡管天然生物防腐劑具有抗菌性強(qiáng)、安全無毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，但普遍存在抑菌譜狹窄的問題，僅使用某一種天然防腐劑以軍效果較差[2]。未改變這一現(xiàn)狀，國內(nèi)外諸多研究人員將注意力轉(zhuǎn)移到天然防腐劑的復(fù)配上，將幾種抑菌譜不同的天然防腐劑進(jìn)行復(fù)配后可擴(kuò)大其抑菌譜、提高抑菌效果[

30、3]。</p><p>　　本文的研究目的就是通過兩種天然防腐劑進(jìn)行一定比例復(fù)配，研究其對大腸桿菌抑菌效果。</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑</p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　烏梅、魚腥草，購于舟山存德堂藥房，制備成提取液后備用。</p><p

31、><b>　　2.2 主要儀器</b></p><p>　　儀器名稱 型號 廠家</p><p>　　烘箱 DHG-9023A 上海林頻環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備廠</p><p>　　冰箱

32、 BCD-199CHG2A 新飛</p><p>　　搖床 ZD-85（A） 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司 雙功能氣浴恒溫振蕩器/搖床培養(yǎng)箱 DNP型 常州菲普實(shí)

33、驗(yàn)儀器廠</p><p>　　水浴鍋 HH-S1 金壇市佳美儀器有限公司</p><p>　　滅菌鍋 YXQ一SG46一2805 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　電子天平 FA1004型

34、 上海精科天平</p><p>　　超級凈化臺 SW-CJ一1F 蘇州凈化設(shè)備有限公司</p><p>　　紫外可見光分光光度計(jì) UV一1201型 北京瑞利分析儀器公司</p><p><b>　　2.3 主要試劑</b></p><p&

35、gt;　　試劑 廠家</p><p>　　營養(yǎng)瓊脂 南京一基生化科技有限公司</p><p>　　蛋白胨 南京一基生化科技有限公司 </p><

36、;p>　　牛肉膏 南京一基生化科技有限公司 </p><p>　　氯化鈉 濰坊海巨化工有限公司</p><p>　　氫氧化鈉 廣東汕頭市西隴化工廠</p&g

37、t;<p>　　葡萄糖 廣東汕頭市西隴化工廠</p><p>　　磷酸二氫鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司廠</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>

38、;　　3.1菌種來源</b></p><p>　　大腸桿菌(E.coli)由市售青占魚、實(shí)驗(yàn)室貯藏南美白對蝦及自然水體中分離獲得。在此實(shí)驗(yàn)中我們將青占魚中的大腸桿菌設(shè)為1號，南美白對蝦中的大腸桿菌設(shè)為2號，自然水體中分離的大腸桿菌設(shè)為3號。</p><p><b>　　3.2培養(yǎng)基制備</b></p><p>　　細(xì)菌固體培養(yǎng)基:牛

39、肉高蛋白胨營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，具體配料為牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，PH7.2，100mL水</p><p>　　細(xì)菌液體培養(yǎng)基(g/L): 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，不加入營養(yǎng)瓊脂。</p><p>　　3.3 烏梅和魚腥草天然抑菌劑的制備</p><p>　　烏梅和魚腥草抑菌劑的制備方法參考吳傳茂等[4]和張穎[5]。</p><p>&

40、lt;b>　　3.4實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.4.1菌懸液的制備[6-7]</p><p>　　菌懸液的制備：從試管斜面上以接種環(huán)挑取少量菌落接種于250mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)，以未接種的液體培養(yǎng)基做空白，每隔2h在600nm波長下比色測定，同時(shí)做細(xì)菌總數(shù)測定，繪制實(shí)驗(yàn)菌種濃度與吸光值坐標(biāo)圖，挑取菌濃度為103cfu/mL的

41、菌懸液，菌濃度達(dá)到要求后立刻將三角瓶保藏于冰箱中備用[8一9]，三角瓶菌液三天之內(nèi)使用。菌體濃度檢測方法采用細(xì)菌總數(shù)檢測法。</p><p>　　3.4.2最低抑菌濃度MIC實(shí)驗(yàn)方法[10一12]</p><p>　　在培養(yǎng)基中加入不同濃度的天然抑菌劑，接入實(shí)驗(yàn)菌種，37℃條件下培養(yǎng)，在指定時(shí)間內(nèi)不長菌的最小天然抑制劑濃度為最低抑菌濃度。</p><p><b

42、>　　4實(shí)驗(yàn)方案</b></p><p>　　4.1烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)合抑制大腸桿菌效果研究</p><p>　　4.1.1烏梅提取液和魚腥草提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)</p><p>　　在參考前人資料和初步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取合適的濃度對獲得的大腸桿菌進(jìn)行最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)。烏梅提取液濃度選取為:10mg/mL，20mg/mL，30m

43、g/mL，40mg/mL;魚腥草提取物的濃度選取為:1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，5mg/mL，9mg/mL。</p><p>　　4.1.2烏梅提取液和魚腥草提取物單獨(dú)作用對大腸桿菌抑制效果的單因素實(shí)驗(yàn)</p><p>　　在3個(gè)實(shí)驗(yàn)菌種中選取生長力最強(qiáng)的的大腸桿菌做為實(shí)驗(yàn)菌種[13]，進(jìn)行抑菌效果的單因素實(shí)驗(yàn)和多因素實(shí)驗(yàn)。單因素實(shí)驗(yàn)水平由最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)獲得，所確定的烏梅提

44、取液的濃度為:12.2mg/mL，18.3mg/mL，22.5mg/mL，36.8mg/mL;魚腥草提取物的濃度為:1mg/mL，1.25mg/mL，1.5mg/mL，1.75mg/mL，2mg/mL。</p><p>　　4.1.3不同濃度烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)合作用對大腸桿菌抑制效果的全面實(shí)驗(yàn)</p><p>　　在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上選擇合適的濃度水平進(jìn)行多因素實(shí)驗(yàn)，因素水平如表

45、1所示：</p><p>　　表1烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)合作用試驗(yàn)因素水平表</p><p>　　4.1.4烏梅提取液和魚腥草提取物的復(fù)合作用最佳抑菌濃度對大腸桿菌抑制試驗(yàn)</p><p>　　取多因素實(shí)驗(yàn)確定的烏梅提取液和魚腥草提取物的最佳復(fù)合抑菌濃度進(jìn)行大腸桿菌抑菌效果實(shí)驗(yàn)，同時(shí)繪制天然抑菌劑對大腸桿菌的生長曲線已確定抑菌劑對大腸桿菌的抑菌效果。[14一15

46、]</p><p>　　4.2烏梅提取物和魚腥草提取物復(fù)合抑制大腸桿菌的效果研究</p><p>　　天然防腐劑共存的條件下可能會出現(xiàn)拮抗作用，影響實(shí)驗(yàn)人員對該防腐劑抑菌效果的觀測。故在實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)人員將烏梅和魚腥草提取液共同作用于同一種微生物，以觀測其抑菌效果。</p><p><b>　　5結(jié)果分析</b><

47、/p><p>　　5.1烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)合抑制大腸桿菌的效果及分析</p><p>　　5.1.1烏梅提取液和魚腥草提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度</p><p>　　通過烏梅提取液和魚腥草提取物單獨(dú)作用對大腸桿菌的最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，兩種天然抑菌劑抑菌效果如表2、表3所示：</p><p>　　表2烏梅提取液不同抑菌濃

48、度作用效果</p><p>　　注：“+++”表示菌落數(shù)量大于100，“++”表示菌落綜述低于100，“+”表示菌落少于10個(gè)，“－”表示無菌</p><p>　　由表2可見烏梅提取液的最低抑菌濃度為20mg/mL。在10mg/mL時(shí)對1號菌和3號菌抑制效果比較好，而烏梅提取液濃度為20mg/mL對2號菌才有較強(qiáng)的抑制作用。這表明：在相同條件下，在市售青占魚、南美白對蝦及自然水體中分離3個(gè)

49、菌株中，2號菌生命力最旺盛。</p><p>　　表3魚腥草提取物不同抑菌濃度作用效果</p><p>　　注：“+++”表示菌落數(shù)量大于100，“++”表示菌落綜述低于100，“+”表示菌落少于10個(gè)，“－”表示無菌</p><p>　　由表3可見，魚腥草提取物的最低抑菌濃度均為2mg/mL，對三種實(shí)驗(yàn)菌株的MIC值相同。從表2和表3中可以看出，在所選用的3株大腸

50、桿菌中，2號菌的菌落數(shù)量最多。故今后實(shí)驗(yàn)中選定2號菌株作為實(shí)驗(yàn)菌種。從表中還可以看出，烏梅提取液的最低抑菌濃度為20mg/mL，魚腥草提取物最低抑菌濃度為2mg/mL，故可以確定單因素水平烏梅提取液為5~20mg/mL，魚腥草提取物為1~2mg/mL。</p><p>　　5.1.2烏梅提取液單獨(dú)作用抑制大腸桿菌的效果及分析</p><p>　　圖1烏梅提取液抑菌效果</p>

51、<p>　　由各種濃度的烏梅提取液抑菌曲線可知，烏梅提取液濃度越高，相同培養(yǎng)時(shí)間下菌液吸光值越小，液體培養(yǎng)基澄清度越高，即菌數(shù)越低，對大腸桿菌抑制效果越強(qiáng)。在圖1中可以觀察到5mg/mL的烏梅提取液在短時(shí)間內(nèi)內(nèi)對大腸桿菌抑制效果極為明顯；10mg/mL的烏梅提取液僅能在短時(shí)間（7 h）內(nèi)對大腸桿菌具有較好的抑制效果；而濃度為15mg/mL與20mg/mL的烏梅提取液對大腸桿菌的抑制效果明顯強(qiáng)于低濃度烏梅提取液。從圖1中還可以

52、看出，在所選用的烏梅提取液濃度中，20h后大腸桿菌濃度都顯著升高。這表明四種實(shí)驗(yàn)濃度對大腸桿菌的抑菌濃度都沒有達(dá)到滿意的試驗(yàn)效果，僅靠烏梅提取液一種天然防腐劑抑菌效果較差。</p><p>　　5.1.3魚腥草提取物單獨(dú)作用抑制大腸桿菌的效果及分析</p><p>　　不同濃度魚腥草提取物單獨(dú)作用對2號菌的抑菌曲線如圖2所示：</p><p>　　圖2魚腥草提取物抑

53、菌效果</p><p>　　由各種濃度魚腥草提取物的抑菌曲線在圖2可知，魚腥草提取物濃度越高，相同培養(yǎng)時(shí)間下菌液OD值越小，液體培養(yǎng)基澄清度越高，即菌數(shù)越低，對大腸桿菌的抑菌效果越強(qiáng)，這與不同濃度的烏梅提取液抑菌效果存在類似情況。其中1mg/mL與1.25mg/mL的魚腥草提取物只能在前8個(gè)小時(shí)內(nèi)抑制住大腸桿菌生長，而后培養(yǎng)基吸光值明顯增大，生長曲線的斜率明顯上升，這表明魚腥草提取液在較低濃度下對大腸桿菌抑菌效果

54、較差；而高濃度下盡管魚腥草抑菌濃度顯著提高（其中1.75mg/mL實(shí)驗(yàn)組中大腸桿菌在24h后才出現(xiàn)顯著增長），但所有實(shí)驗(yàn)組中大腸桿菌仍然在24h數(shù)量有顯著上升。這表明四種實(shí)驗(yàn)濃度對大腸桿菌的抑菌濃度都沒有達(dá)到滿意的試驗(yàn)效果，僅靠魚腥草提取液一種天然防腐劑抑菌效果也較差。此外，從圖2中還可以看出，較低濃度的魚腥草提取液（1mg/mL與2mg/mL）抑菌效果差距明顯，這表明在最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)中所有菌在魚腥草提取物1mg/mL時(shí)生長量較大，而

55、在魚腥草提取物2mg/mL時(shí)大腸桿菌不生長。這也從側(cè)面證明了魚腥草MIC測定的正確。</p><p>　　5.1.4不同濃度的烏梅與魚腥草復(fù)合作用全面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析</p><p>　　考察烏梅與魚腥草復(fù)合作用對2號菌的抑制效果。不同復(fù)合抑菌濃度下，其抑菌效果如圖3、圖4、圖5、圖6所示:</p><p>　　（1）5mg/mL烏梅與不同濃度魚腥草復(fù)合作用效果:&l

56、t;/p><p>　　圖3烏梅與魚腥草提取物復(fù)合作用抑菌效果</p><p>　　由圖3可見，在魚腥草提取物濃度一定時(shí)，烏梅提取液的含量并非越高抑菌效果就越好。分析其原因可能是由于烏梅與魚腥草提取物中抑菌活性物質(zhì)不同而引起。魚腥草具有抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫力、利尿等作用。魚腥草含一種天然的抗生素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，魚腥草所含揮發(fā)油中的主要成分為甲莖正壬基酮、月桂烯、月桂醛等，還有櫟素。臨床

57、報(bào)道廣泛用于治療肺炎、咯血、上呼吸道感染、慢性支氣管炎、百日咳、流感等；此外，魚腥草所含有的魚腥草素在體外試驗(yàn)對卡他球菌、流感桿菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用。而烏梅中所含有的活性抑菌成分主要為檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸類，使得烏梅提取物pH較低。當(dāng)僅僅以烏梅為抑菌物時(shí)，烏梅提取液濃度越高，pH越低，則抑菌效果越好。而當(dāng)烏梅提取液與魚腥草提取物混合在一起后，高酸性條件下，魚腥草中某些物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，從而引起其抑菌活性的

58、直接降低。</p><p>　　為了確定烏梅和魚腥草兩種天然防腐劑的最佳配比就必須在進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行多因素實(shí)驗(yàn)。當(dāng)濃度為1mg/mL的魚腥草提取物與5mg/mL的烏梅提取液抑菌復(fù)配后抑菌效果仍然較差（大腸桿菌有效抑制時(shí)間不超過8h），這可能是由于烏梅提取液含量過低，使得混合液酸度不夠，溶液pH較高，大腸桿菌仍然可以正常生長；在探討其他烏梅提取液濃度與魚腥草濃度復(fù)配抑菌效果后發(fā)現(xiàn)：而當(dāng)烏梅提取液提高至10

59、～20mg/mL時(shí)，兩種天然防腐劑的抑菌時(shí)間明顯延長（在16h內(nèi)可有效抑制大腸桿菌的生長）。這表明：在節(jié)約成本的前提下，可選用較低濃度的烏梅提取液與魚腥草進(jìn)行復(fù)配，即10mg/mL烏梅提取液的抑菌效果可滿足實(shí)驗(yàn)需要。在此基礎(chǔ)上，我們選擇10mg/mL烏梅提取液作為復(fù)配濃度。</p><p>　?。?）1.25mg/mL魚腥草提取物與不同濃度烏梅提取液復(fù)合作用效果：</p><p>　　圖4

60、烏梅與魚腥草提取物復(fù)合作用抑菌效果</p><p>　　從圖4可見，當(dāng)魚腥草濃度為1.25mg/mL時(shí)，烏梅濃度為5mg/mL，兩者復(fù)配抑菌有效期為26小時(shí)，；當(dāng)烏梅濃度為10~20mg/mL時(shí)，菌液吸光值相對較小，但后期增加較快，這表明仍不能完全抑制大腸桿菌生長。綜合各實(shí)驗(yàn)組得出：烏梅四個(gè)濃度抑菌效依次為10mg/mL>15mg/mL>20mg/mL>5mg/mL。</p>&l

61、t;p>　?。?）1.5mg/mL魚腥草與不同濃度烏梅提取液復(fù)合作用效果：</p><p>　　圖5烏梅與魚腥草提取物復(fù)合作用抑菌效果</p><p>　　由圖5可以看出，在所選用的烏梅提取液濃度中，抑菌效果并不是隨著烏梅提取液濃度升高而增強(qiáng)，與魚腥草復(fù)配后低濃度烏梅提取液抑菌效果反而高于高濃度提取液。這與前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相反，這可能是由于當(dāng)兩種天然防腐劑復(fù)配后，魚腥草濃度增加后，有效

62、抑菌活性物質(zhì)濃度增加，低濃度烏梅提取液（10mg/mL和5mg/mL）的酸性物質(zhì)恰恰給魚腥草有效抑菌活性物在提供了適宜的pH環(huán)境，使得魚腥草中活性益菌成分能夠最大程度發(fā)揮其抑菌效果。</p><p>　?。?）1.75mg/mL魚腥草提取物與不同濃度的烏梅提取液復(fù)合作用效果:</p><p>　　圖6烏梅與魚腥草提取物復(fù)合作用抑菌效果</p><p>　　圖6是1.

63、75mg/mL魚腥草提取物與不同濃度烏梅提取液復(fù)配后的抑菌效果圖。從圖中可以看出，兩種天然防腐劑復(fù)配后的抑菌效果與圖5類似，在魚腥草提取液濃度確定后同樣不是烏梅提取液濃度越高，抑菌效果越好。不同實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)過程中對大腸桿菌均有較好的抑菌效果，而在四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中同樣是較低濃度的烏梅提取液抑菌效果較好。對于魚腥草提取液抑菌效果而言，當(dāng)濃度由1.5mg/mL上升到1.75mg/mL，在相同條件下（魚腥草濃度1.5mg/mL、烏梅提取液濃度10m

64、g/mL/魚腥草濃度1.75mg/mL、烏梅提取液濃度10mg/mL），高濃度魚腥草抑菌效果反而不如低濃度。</p><p><b>　　(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行最佳配比的確定實(shí)驗(yàn)：魚腥草提取物1mg/mL，烏梅提取液10mg/mL(編號為a);魚腥草提取物l.25mg/mL，烏梅提取液10mg/mL(編號為b);魚

65、腥草提取物l.5mg/mL，烏梅提取液5mg/mL(編號為c);魚腥草提取物l.75mg/mL，烏梅提取液5mg/mL(編號為d)，以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)菌種確定最佳配比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。</p><p>　　圖7不同濃度下烏梅與魚腥草提取物復(fù)合抑菌效果</p><p>　　圖7是不同濃度下烏梅和魚腥草抑菌效果實(shí)驗(yàn)圖。從圖中可以看出不同配比的實(shí)驗(yàn)組抑菌效果差距較大。在實(shí)驗(yàn)過程中，總體而言c組

66、對大腸桿菌的抑菌效果要顯著好于其他三組，而從圖7還可以看出，盡管在培養(yǎng)一段時(shí)間后（培養(yǎng)時(shí)間大于8h），在相同條件下c組抑菌效果最好，但d組對大腸桿菌的初始抑制效果最強(qiáng)，培養(yǎng)時(shí)間低于8h時(shí)，培養(yǎng)基溶液仍然保持澄清透明，培養(yǎng)時(shí)間超過12h后大腸桿菌生長才開始逐漸旺盛起來。但總體而言，我們選擇c組為最佳配比組，即兩種天然防腐劑的配濃度為魚腥草提取物l.5mg/mL，烏梅提取液5mg/mL。</p><p><b&

67、gt;　　6小結(jié)</b></p><p>　　烏梅提取液和魚腥草提取物對大腸桿菌進(jìn)行抑制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:</p><p>　　(1)烏梅提取液和魚腥草提取物復(fù)配后對大腸桿菌的抑制效果：</p><p>　?、賹?shí)驗(yàn)中大腸桿菌實(shí)驗(yàn)濃度為103MNP/100mL，根據(jù)前半部分也就是單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，烏梅提取液天然防腐劑的MIC為20mg/mL，而魚腥草天然防腐劑M

68、IC為2mg/mL，這兩種天然防腐劑進(jìn)行單獨(dú)抑菌效果測定時(shí)均體現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)濃度越高，抑菌效果越好的特點(diǎn)；而將兩種生物防腐劑復(fù)配后，每種天然防腐劑的用量可大大降低，復(fù)配最佳比例為烏梅提取液5mg/mL魚腥草提取物 1.5mg/mL。</p><p>　?、跒趺诽崛∫号c魚腥草提取物的最佳復(fù)配濃度用于食品中常見的致病菌大腸桿菌具有良好的抑制效果。</p><p>　　生物防腐劑與化學(xué)防腐劑相比其安全

69、性高、對人體無毒無害，但今后不論何種防腐劑，使用均要符合GB-2760，這一硬性要求使得動物源生物防腐劑和微生物源生物防腐劑的應(yīng)用受到極大限制，而本文中所選用的植物源天然防腐劑屬于藥食兩用植物來源，符合2760標(biāo)準(zhǔn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)中由于研究時(shí)間緊迫、實(shí)驗(yàn)條件以及本人水平有限，個(gè)別實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理上可能存在一定偏差。尤其是在進(jìn)行兩種生物防腐劑的研究試驗(yàn)中，我們選用的大腸桿菌菌懸液濃度較低，為103MNP/mL，這盡管高于生產(chǎn)中的

70、實(shí)際情況，但作為實(shí)驗(yàn)研究還是相對較低，本研究還有大量的工作有待于進(jìn)一步開展。</p><p><b>　　[參考文獻(xiàn)] </b></p><p>　　[1] 張文治.新編食品微生物學(xué)[M] .北京:中國輕工業(yè)出版社,1995</p><p>　　[2] 王宇珊.天然食品防腐劑的研究現(xiàn)狀[A].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,第21卷第5期

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75、t;/p><p>　　[13] 林科.一食品防腐劑的種類及其研究進(jìn)展[A].食品與生物.2009年10月,第10期:9一10</p><p>　　[14] 鄔蘇曉,肖正中.馬齒莧對豬大腸埃希菌抑菌作用觀察[B].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2010,31(3):126一128</p><p>　　[15] 安本光政,等.日本食品科學(xué)工會第42回大會演講集.1995,3:2一9.<

76、;/p><p><b>　　附錄Ⅰ英文翻譯</b></p><p>　　淡褐奧德蘑的抗菌能力評估</p><p><b>　　（擔(dān)子菌）</b></p><p>　　Hossein Vahidi* and Forogh Namjoyan</p><p>　　藥學(xué)系生藥學(xué)科， 大學(xué)

77、藥學(xué)科學(xué)系</p><p>　　[摘要] 以不同的真菌（白色念珠菌，酵母菌，多主枝孢，黑曲霉）以及細(xì)菌（微球菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，葡萄球菌）作為測試的有機(jī)體，用各種的抗菌試驗(yàn)方法包括抗生素選用及瓊脂紙錠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，稀釋法用于檢驗(yàn)提取物的活性，從液體介質(zhì)中成長起來的不同的培養(yǎng)基提取物中的淡褐奧德蘑的抗菌能力得到測試。相關(guān)的抑菌濃度值表明了真菌的乙酸乙脂與提取物細(xì)菌和真菌相反</p><p&

78、gt;　　[關(guān)鍵詞] 淡褐奧德蘑；擔(dān)子菌；抗菌</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　自從十九世紀(jì)二十年代以來，在一些醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對治療法提出了一些新的挑戰(zhàn)，這些新的領(lǐng)域需要有毒性小，更為有效的抗生素以及微組織演變而來的抗性，同時(shí)相應(yīng)的情況也出現(xiàn)在了農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[1]。這些元素對尋找新的生物活性的混合物注入了新的活力。擔(dān)子菌（蘑菇）對于基因庫研究

79、源來說，具有非常高的價(jià)值，但在它抗真菌性和抗細(xì)菌性能力上這個(gè)研究領(lǐng)域還是投入比較少的[2]。</p><p>　　淡褐奧德蘑是一種腐生的真菌，大多數(shù)生長在木材上?？梢詮牡謯W德蘑中分離出來不同的抗菌劑。淡褐奧德蘑以及螺粘液殺菌素從長根菇中分離出來，表明具有一種抗真菌性，從而淡褐奧德蘑的抗真菌性得以發(fā)現(xiàn)[3]。這種真菌具有抗白色念球菌，煙曲菌的特性[4]。</p><p><b>

80、　　2實(shí)驗(yàn)</b></p><p><b>　　2.1真菌</b></p><p>　　1997年11月這種真菌在愛爾蘭的北部收集，稱之為淡褐奧德蘑，存于Shaheed Beheshti大學(xué)藥學(xué)系生物學(xué)科藥學(xué)科學(xué)。</p><p>　　2.2提取物的成長和準(zhǔn)備</p><p>　　用真菌的菌蓋進(jìn)行組織培養(yǎng)[5

81、]，在1/10g葡萄糖，1/10麥芽提取物，1/3g酵母提取物以及真菌蛋白的液體中培養(yǎng)介質(zhì)菌絲體。十天之后，過濾培養(yǎng)基，用不同的方法分別提取濾液，包括乙酸乙酯，三氯甲烷，石油醚。在對比壓力下，每一種提取物得以濃縮。測試之前，在室溫4度狀態(tài)下，標(biāo)為濃縮的產(chǎn)物以及對其進(jìn)行保存。</p><p>　　表1. 淡褐奧德蘑培養(yǎng)基開始時(shí)的抗菌活性</p><p><b>　　2.3微生物測試

82、</b></p><p>　　微生物包括真菌和細(xì)菌，他們來自于波斯式培養(yǎng)物寄存庫以及美國式培養(yǎng)物寄存庫。</p><p>　　白色念珠菌（PTCC5027），解脂假絲念珠菌（ATCC825），酵母菌（ACTT9783），多主枝孢，（Tehran大學(xué)，健康學(xué)院），以及黑曲菌作為檢測生物體以及微球菌（ATCC9273）作為檢驗(yàn)有機(jī)體的真菌，大腸桿菌（PT1330），金黃色葡萄球菌（

83、PTCC1112）和表皮葡萄球菌（PTCC1114）用于檢測細(xì)菌檢測有機(jī)體。準(zhǔn)備3*107 cfu/mL細(xì)菌懸液，與Mc Farland標(biāo)準(zhǔn)的一號試管進(jìn)行對比，以Neubauer計(jì)算池，準(zhǔn)備絲狀酵母真菌，酵母菌，懸液有106cfu/mL。</p><p><b>　　3抗菌實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　3.1瓊脂紙錠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)</p><p>

84、;　　為了使細(xì)菌生長，準(zhǔn)備一些90毫米皮氏培養(yǎng)皿中盛放Muller Hinton瓊脂，為了使酵母類真菌成長，準(zhǔn)備酵母類真菌麥精瓊脂，用脫脂棉，在瓊漿的整個(gè)表面，用防菌性方法，把每個(gè)盤子盛裝不同的酵母類真菌和細(xì)菌培養(yǎng)基。用一個(gè)直徑6毫米的圓盤狀過濾紙，每個(gè)提取物以20 μl，純酒精，使其滲透。這些濾紙是真空的，無菌放置在盤中心，再將這些盤子互不干擾的放置一個(gè)小時(shí)，以至于這種提取物能夠稀釋在瓊漿中。氯霉素和制真菌素，戲是在了純酒精中，在盤中

85、滲透，真空，作為一種陽性對照。這些盤子需要在一個(gè)預(yù)定的溫度中進(jìn)行培養(yǎng)。在干凈的空間內(nèi)，表現(xiàn)出一種生長抑制，并且得以檢測。抑制性的評估進(jìn)行復(fù)制。</p><p><b>　　3.2微細(xì)胞盤技術(shù)</b></p><p>　　對于絲狀真菌，準(zhǔn)備96微細(xì)胞盤。20μl的孢子懸液和100μl液體培養(yǎng)基（麥精提取物）進(jìn)行添加。在10%二甲基亞中添加100μl的提取物，將盤子儲存在

86、25度中，儲存48小時(shí)。制真菌素（100 mg/ml）為正控制，二甲基亞為負(fù)控制，進(jìn)行顯微鏡檢測后，結(jié)果是孢子發(fā)芽抑制（(100%, 80%, 50%, 20% 和0%）[6-7]</p><p>　　表2 絲狀真菌的孢子發(fā)芽抑制</p><p>　　3.3低抑菌濃度檢測</p><p>　　使用一系列的稀釋方法，判斷出提取物的低抑菌濃度值表現(xiàn)出一種較強(qiáng)的活性。每種

87、提取物一系列的稀釋物分別放標(biāo)有1到6的試管中。試管1裝有100μl儲備溶液（200 mg/ml, 10% DMSO），試管1中只有50μl儲備溶液轉(zhuǎn)移到試管2中，以10%的DMSO溶液和50 μl進(jìn)行稀釋。對于2號到6號試管，重復(fù)這個(gè)過程。為了獲得測試物（40, 20, 10, 5, 2.5 1.25 and 0.63 μg/μl）溶液，每個(gè)試管都裝滿了100μL muLler hinton細(xì)菌，真菌提取物的液體培養(yǎng)基，還有100μL孢

88、子或者細(xì)菌懸液，徹底攪拌混合物，在25度室溫下培養(yǎng)真菌，37度下培養(yǎng)細(xì)菌，整夜后，制真菌素(200 mg/mL)和氯霉素(200 mg/mL)用作正控制，DMOS為負(fù)控制。肉眼評估后，最低的濃度，并且溶液清澈，渾濁度可以作為這樣一個(gè)指標(biāo)，進(jìn)行記錄。低抑菌濃度檢測作為一種多次記錄的平均值進(jìn)行記錄。</p><p><b>　　4結(jié)果和討論</b></p><p>　　5

89、00毫升的真菌培養(yǎng)基濾液的提取物得出以下產(chǎn)物：乙酸乙酯提取物（0.05% W/V），三氯甲烷，0.02% （W/V），石油醚(0.01% W/V)</p><p>　　從以上空置量中得出的結(jié)論表明溶劑對于真菌和細(xì)菌的菌株沒有任何影響。在研究的眾多提取物中，只有乙酸乙酯提取物表現(xiàn)出了一種較強(qiáng)的活性。這種提取物表現(xiàn)出M溶液中表現(xiàn)出高的篩選性，呈現(xiàn)出一種相對高的抑菌圈（18.4毫米）（表1），相反，作為抑菌圈表現(xiàn)出的多

90、樣性，對于各種酵母類，如真菌，他們的提取物是非選擇性的。通過賦予最低的相關(guān)的最小提取物也表現(xiàn)為一種較強(qiáng)的活性，通過10μg/μL植物標(biāo)本抑制濃度值，抑制絲狀真菌（表3）。</p><p>　　TABLE 3.最低抑菌濃度測驗(yàn)(µg/µL)</p><p>　　對于抵抗檢測的微組織，三氯甲烷真菌的提取物特別具有活性，特別是絲狀真菌。觀察到黑色消化球菌和多主枝孢40μg/μ

91、L相對小的抑制濃度值。當(dāng)石油醚作為提取溶劑時(shí)，觀察不到其活性。但是有趣的是，提取物表現(xiàn)出一種抗檢測菌的活性。因此，在真菌的石油提取物中存在某種特殊的活性混合物的可能性相當(dāng)?shù)母?，醋酸鹽提取物表現(xiàn)出一種較強(qiáng)的抗C植物標(biāo)本和A黑色消化球菌孢子100 % 和 80 %的抑制性。有趣的是，不同的提取物表現(xiàn)出一種抗被檢測的微有機(jī)體的較強(qiáng)的活性。</p><p>　　References</p><p>

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97、 Biol. (2003)41: 392-397.</p><p><b>　　附錄Ⅱ 英文原文</b></p><p>　　Evaluation of Antimicrobial Activity of Oudemansiella sp(Basidiomycetes)</p><p>　　Hossein Vahidi* and Forogh

98、Namjoyan</p><p>　　Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Shaheed Beheshti University of Medical</p><p>　　Sciences, Tehran, Iran.</p><p>　　[Abstract] Antimicrobial activity

99、 of different culture extract of Oudemansiella sp grown on liquid medium (MYGP) were tested. Different fungi (C. albicans, C. lipolytica, Saccharomyces cervisiea, Cladosporium herbarum, and Aspergillus niger) and bacteri

100、a (Microccocus luteus,E. coli, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus epidermidis) were used as test organisms.Various antimicrobial assay methods including paper disc agar diffusion and microdilutionmethod, were empl

101、oyed to determine possible </p><p>　　[Key words] Oudemansiella sp; Antimicrobial; Basidiomycetes.</p><p>　　Introduction</p><p>　　The need for less toxic, more potent and nonanti - i

102、nfectives antibiotics, as well as theevolving resistance of microorganisms are someof the medical areas that have posed a challenge to therapeutics since 1990s. Acorresponding situation exists in the agricultural sectors

103、. These factors have the combined effect of injecting a sense of urgency into the search for new bioactive compounds (1). The basidiomycetes (mushrooms) are valuable as gene pool sources, which have not yet been the subj

104、ect of e</p><p>　　Oudemansiella (Fam. Tricholomatacea) is a saprophytic fungus, found mostly growing on wood. Different antifungal agents have been isolated from the Oudemansiella genus. Oudemansin and mucid

105、in were isolated from the Oudemansiella radicata, showing an antifungal activity (3). Antifungal activity of Oudemansiella platyphylla has also been reported. The fungus has shown activity against C. albicans, C. tropica

106、lis and A. fumigatus (4).</p><p>　　Experimental</p><p>　　Fungus material</p><p>　　The fungus was collected in November 1997 from the northern parts of Iran. Next, the fungus was ide

107、ntified as Oudemansiella sp and stored in the Department of Pharmacognosy at the School of Pharmacy, Shaheed Beheshti University of Medical Sciences (Voucher number 01- Ram 97).</p><p>　　Growth and preparati

108、on of extracts</p><p>　　Tissue culture was carried out, using the cap of the fungus (5). Mycelium of the fungus was cultured in a liquid medium containing 10 g/l glucose, 10 g/l malt extract, 3 g/l Yeast ext

109、ract and mycological peptone. After 10 days the culture was filtered and filterate was separately extracted with different solvents including ethyl acetate, chloroform and petroleum ether respectively. Each extract was c

110、oncentrated under reduced pressure. The condensed products were weighed and kept at 4°C perior to</p><p>　　TABLE 1.The preliminary antimicrobial activity of Oudemansiella Sp(1mg/disc) culture extract<

111、;/p><p>　　*mm zone of inhibitionnt:not tested</p><p>　　Test microorganisms</p><p>　　Microorganisms including fungi and bacteria were obtained from the Persian Type Culture Collection

112、 (PTCC) as well as the American type culture collection (ATCC). </p><p>　　Candida albicans (PTCC 5027), Candida lipolytica (ATCC 825), Saccharomyces cervisiea (ATCC 9783), Cladosporium herbarum (School of He

113、alth, Tehran University), and Aspergillus niger (PTC5010), were used as the fungal tested organisms and Micrococcus lutes (ATCC 9273), E. Coli (PTCC1330), Staphylococcus aureus (PTCC1112), and Staphylococcus epidermidis

114、(PTCC1114) used as the bacterial tested organisms. For the bacterial suspension, 3× 107 cell /ml was prepared, compared to that of the Mc Farland s</p><p>　　Antimicrobial assay</p><p>　　Pap

115、er disc agar diffusion method </p><p>　　Aseries of 90 mm Petri dishes containing the Muller Hinton agar for the growth of bacteria and the malt extract agar for the growth of yeast-like fungi were prepared a

116、nd each plate was separately inoculated with different cultures of the yeast like fungi and bacteria by swabbing aseptically on the whole surface of the agar with cotton wool. A 6 mm diameter filter paper disc was impreg