2015毛細(xì)管電泳

1、1,第一節(jié) 概述,電泳（Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場的作用下向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。將電泳發(fā)展成為分離技術(shù)應(yīng)歸功于Tiselius (瑞典,蒂塞利烏斯)的工作。他于1937年建立“移界電泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為白蛋白、α、β、和γ球蛋白，這項工作成為蛋白質(zhì)化學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，因此Tiselius本人榮獲1948年諾貝爾化學(xué)獎。

2、,第15章 毛細(xì)管電泳法,,電泳（ C）槽和電極（ V1、V2 ）,2,,經(jīng)典電泳法散熱差，分離電壓受到限制。1981年，Jorgenson和Lukacs發(fā)表了在毛細(xì)管電泳發(fā)展史上具有劃時代意義的工作，他們采用75μm內(nèi)徑的石英毛細(xì)管做為分離室，紫外柱上檢測的方法，在30kv的分離電壓下分離丹酰化氨基酸，柱效達到40萬個理論塔板。他們的工作為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。,James W. JorgensonNorth I

3、llinois University化學(xué)系教授,3,第二節(jié) 基本原理,電泳（electrophoresis）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場中定向移動的現(xiàn)象。電泳淌度：單位電場強度下，帶點粒子的電泳速率。 式中 －電泳遷移率（電泳淌度）， 為電泳速率,一、電泳和電泳淌度,電泳淌度與帶電粒子半徑（r）及電荷（q）間的關(guān)系,,電泳淌度的差異構(gòu)成了電泳分離的基礎(chǔ),4,二、電滲和電滲淌度,電滲（elec

4、troosmosis)是毛細(xì)管電泳分離理論中最基本的概念之一。,5,電滲是指在電場作用下，毛細(xì)管中或固相多孔物質(zhì)內(nèi)，電解質(zhì)溶液朝一個方向遷移的現(xiàn)象。電滲速率 與固液兩相界面的雙電層Zeta電位 ，緩沖溶液的介電常數(shù) 和黏度 有關(guān)，與電場強度成正比。單位場強下的電滲速率 ，稱為電滲淌度,,6,三、表觀淌度和遷移時間,由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負(fù)離子還是中性分子，均隨電滲流移動。,7

5、,1)CE中電滲流的流形,電荷均勻分布，整體移動,電滲流的流動為平流,塞式流動（譜帶展寬很?。?高效液相色譜中的溶液流動為層流,拋物線流型,管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。,,四、柱效和分離度,8,2） CE中電滲流的作用,電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍； 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： 陽離子運動方向與電滲流一致；

6、 陰離子運動方向與電滲流相反； 中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性； 在CE中，控制電滲流非常重要。,9,3)無渦流擴散項與傳質(zhì)阻力項,在HPCE中，僅存在

7、縱向擴散，H=B/u,擴散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。,影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：,為兩組分電泳淌度的差值,10,第三節(jié) 毛細(xì)管電泳儀和實驗操作,一、毛細(xì)管電泳儀,11,1.高壓電極槽和進樣機構(gòu) 2.填灌清洗機構(gòu) 3.毛細(xì)管 4.檢測器 5.鉑絲電極 6.低壓電極槽 7.恒溫系統(tǒng) 8.數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),自動型毛細(xì)管電泳儀結(jié)構(gòu)示

8、意圖,12,CE的要求：,▲進樣機構(gòu)不存在死體積，能進行精確的進樣控制?！栌忻?xì)管清洗機構(gòu)?！邏弘娫粗辽賾?yīng)能輸出200μA×25kV的功率。▲檢測器盡量安裝在接地端，優(yōu)先考慮柱上紫外檢測方式?！?溫控范圍寬，以0 ℃為界，越寬越好，上限不應(yīng)低于50 ℃ ，最好能達到65～70 ℃ ，至少能在20～40℃內(nèi)恒溫，恒溫精度應(yīng)小于±0.1 ℃ 。,13,高壓電源一般采用（0 ~±30）kV連續(xù)可調(diào)的直

9、流高壓電源，一般要求電壓穩(wěn)定在±0.1%。電極通常由直徑0.5mm ~1mm的鉑絲制成。電極槽通常是帶螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml ~ 5ml不等），以便于密封。儀器必須接地，操作過程中必須注意高壓的安全保護。,一、高壓電源,14,二、毛細(xì)管,1.尺寸 毛細(xì)管尺寸的選擇與分離模式和樣品有關(guān)。自由溶液電泳多選用50或75μm內(nèi)徑的毛細(xì)管，分離的有效長度?？刂圃?0～100cm之間。如進行大顆粒如紅細(xì)胞的分離，則需要內(nèi)徑

10、大于 300μm的毛細(xì)管。CGE或CEC的有效長度一般控制在20cm左右。 2.涂層 外壁涂一層聚酰亞胺保護層 ，一般內(nèi)壁不需涂層處理。大分子化合物分離時，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE時，需要涂層毛細(xì)管以抑制電滲。在分離中，有時為了加強電滲或改變其方向，也需要涂層毛細(xì)管。,15,3. 清洗毛細(xì)管在使用過程可能被污染，從而影響分析的結(jié)果。為使測定具有良好的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在使用時應(yīng)經(jīng)常清洗。▲空管通常用 0.

11、l～1mol/L NaOH、水和緩沖液順序沖洗，各洗5~10min，或增加有機溶劑如甲醇清洗步驟，以除去管中的脂溶性吸附組分。如果懷疑管內(nèi)壁吸附有蛋白質(zhì)或其他有機分子，可用0.l～1mol/L的HNO3洗 5～10min，然后再按常規(guī)清洗。▲兩次分析之間，可用運行緩沖液清洗、平衡。,16,三、進樣系統(tǒng),毛細(xì)管通道十分細(xì)小，所需樣品不過數(shù)nl，所以不能采用色譜的進樣方式。通過讓毛細(xì)管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電場力或其它動力來驅(qū)動

12、樣品進入管中。進樣量可以通過控制驅(qū)動力的大小或時間長短來控制。進樣系統(tǒng)必須包括動力控制、計時控制、電極槽或毛細(xì)管移位控制等機構(gòu)。 進樣方式：1、壓力法（流體力學(xué)進樣） 2、電動法,17,1、壓力進樣,也稱流動進樣，它要求毛細(xì)管中的填充介 質(zhì)具有流動性。當(dāng)毛細(xì)管兩端置于不同的 壓力環(huán)境中時，管中溶液即能流動，將樣 品帶入。可用三種方法產(chǎn)生進樣動力：正壓、負(fù)壓

13、 （管尾抽吸）、重力（虹吸）。采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實現(xiàn)正壓 進樣，并可與毛細(xì)管清洗系統(tǒng)共用，多 為商品儀器采用。優(yōu)點：壓力進樣沒有偏向問題，缺點：選擇性差，樣品及其背景同時被引入 管中，對后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。,18,電動進樣,當(dāng)把毛細(xì)管的進樣端插入樣品溶液并加上電場時，組分就會因電遷移和電滲作用而進入管內(nèi)。電動進樣的控制參數(shù)是電場強度E和進樣時間t。電場強度E取值多在1～60kv/60

14、cm 之間；進樣時間通常在1～10s 之間，有時可達1min或更大。優(yōu)點：電動進樣對毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特殊限制，屬普適性方法，可實現(xiàn)自動化操作。缺點：電動進樣對離子組分存在偏向，降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性。,19,四. 檢測器,在毛細(xì)管電泳中，毛細(xì)管柱內(nèi)徑?。ㄍǔ?0μm或75μm)，區(qū)帶體積小，僅為nl級，區(qū)帶遷移速度快，這就對檢測器提出了很高的要求。毛細(xì)管電泳要求檢測方法必須具有很高的靈敏度和很快的響應(yīng)速度，且不能引起區(qū)帶擴

15、張。常用柱上檢測法,20,紫外檢測,由于紫外檢測器價格便宜，通用性好，石英毛細(xì)管柱有良好的紫外透過性，易于實現(xiàn)柱上檢測；再加上大多數(shù)有機化合物包括蛋白質(zhì)等生物大分子都含有紫外發(fā)色團，所以它是目前應(yīng)用最廣的檢測器。但是，由于受毛細(xì)管內(nèi)徑的限制，檢測靈敏度較低。 固定波長檢測器 可變波長檢測器 二極管陣列檢測器,,21,激

16、光誘導(dǎo)熒光（LIF）,采用激光（強度高，準(zhǔn)直性好，可聚焦成比毛細(xì)管更細(xì)的光束射入毛細(xì)管內(nèi)部），激發(fā)出強的熒光。LIF能減小因毛細(xì)管壁的散射所引起的背景噪聲。,1.激光器 2.高壓電源 3.毛細(xì)管 4.單色器 5.光電倍增管 6.記錄儀 8.激發(fā)光光纖 9.熒光收集光纖,22,其他檢測器,電化學(xué)檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器質(zhì)譜檢測器,23,第四節(jié) 定性和定量分析方法,一、定性分析方法,以相對遷移時間與對照品對

17、比定性；與質(zhì)譜聯(lián)用定性。,二、定量分析方法,1、內(nèi)標(biāo)法2、疊加對比法,24,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳的主要分離模式,毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）膠束電動色譜（micellar electrokinetic chromatography, MEKC)毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis, CGE)毛細(xì)管等速電泳（capillary isot

18、achophoresis, CITP) 毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focus, CIF)毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, CEC),25,一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CZE）,毛細(xì)管電泳最基本的分離模式。背景電解質(zhì)是緩沖液，分離是基于樣品中各個組分間質(zhì)荷比的差異。有時需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細(xì)管壁的吸附等

19、。在CZE中，影響分離的操作條件為： ◆分離電壓 ◆背景電解質(zhì)種類、濃度和pH ◆添加劑種類和濃度,26,分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。在實際分離中，如果所用的毛細(xì)管很細(xì)或緩沖液的電導(dǎo)很低，極大電壓可能會超出儀器范圍，此時沒有最佳電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。當(dāng)毛細(xì)管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時，極大電壓可能很小，若此時分離度很高，也可選擇大于極大值的電壓進行分離。,1

20、. 分離電壓,27,毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。溫度的確定也應(yīng)通過實驗，多數(shù)情況下，在20～30℃之間進行電泳，能獲得良好的分離效果?？筛鶕?jù)初步分離結(jié)果調(diào)整溫度。不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，一些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。,2.分離溫度,28,對背景電解質(zhì)的要求：①在所選擇的pH范圍內(nèi)有足夠大的緩沖容量。②在檢測

21、波長處的吸收低。③自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。④應(yīng)使被測組分帶合適的電荷量，以實現(xiàn)有效進樣和有合適的電泳淌度。⑤盡可能采用酸性緩沖溶液，在低pH下，吸附和電滲流值都很小。⑥與毛細(xì)管種類匹配，涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用。,3. 背景電解質(zhì),29,在CZE中，常用于毛細(xì)管電泳的緩沖溶液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。 緩沖體系的pH值要求與樣品的性質(zhì)有關(guān)，通常酸性組分的分離

22、選擇在堿性條件下進行，而堿性組分則選擇酸性介質(zhì)分離，蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等兩性物質(zhì)，可選酸性(pH2)也可選堿性(pH>9)分離介質(zhì)。糖類樣品通常在pH9~11之間能獲得最佳分離，羧酸或其它樣品多在pH5~9之間選擇分離條件。,30,二、膠束電動色譜法（MEKC）,在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑（如SDS），當(dāng)表面活性劑濃度超過其臨界膠束濃度時，則形成膠束，膠束具有疏水內(nèi)核, 外層帶負(fù)電荷。溶質(zhì)分子則在極性緩沖液與膠束中心的非極

23、性相（假固定相）之間有一定的分配。 中性分子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異。在電滲流作用下，膠束攜帶溶質(zhì)一起前行，疏水性強的溶質(zhì)和膠束結(jié)合得較牢，流出慢。溶質(zhì)分子由于表觀淌度及其在兩相中的分配系數(shù)的差異是MEKC分離的基礎(chǔ)。,31,常用的陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）、N-月桂酰-N-甲基?；撬徕c（LMT）、?；敲撗跄懰徕c（STDC）等。陽離子表面活性劑最常用的是季銨鹽，如十二烷基三甲基溴

24、化銨（DTAB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。非離子型表面活性劑有3-[3-(氯化酰胺基丙基)二甲基胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。另外，還有手性表面活性劑，如膽酸、毛地黃皂苷、十二烷基-N-L-纈氨酸鈉等。,32,表面活性劑選擇時應(yīng)考慮以下因素：（1）經(jīng)濟易得（2）水溶性好（3）紫外吸收背景越低越好（4）不與樣品發(fā)生破壞性作用（5）所形成的膠束足夠穩(wěn)定,33,三、環(huán)糊精修飾毛細(xì)管電泳法,將適量環(huán)糊精及其衍

25、生物加入緩沖溶液作為添加劑而進行的毛細(xì)管電泳。,,分離手型異構(gòu) 體常用的方法。,環(huán)糊精，吡喃葡萄糖單元構(gòu)成錐筒形結(jié)構(gòu)。待分離組分的分子大小，相對極性，與CD環(huán)鑲嵌關(guān)系決定手性分子的表觀淌度。,34,四、毛細(xì)管電色譜（CEC）,以微填充柱作為分離柱，以電滲流（電滲+液壓）驅(qū)動流動相完成色譜分離過程。,基于組分的分配系數(shù)和電泳淌度及的差異實現(xiàn)組分的分離。,35,CEC中，固定相的選擇主要依據(jù)HPLC的理論和經(jīng)驗，常用C18或C8 。 根

26、據(jù)固定相的特性（正相、反相等），緩沖液可以是水溶液或有機溶液。常用乙腈－水或甲醇－水等為流動相。,五、毛細(xì)管凝膠電泳,分離機理基于電泳與凝膠色譜的組合,36,毛細(xì)管分離條件選擇流程,1.盡可能多地了解樣品的類型、來源、組成及其性質(zhì)。2.根據(jù)樣品性質(zhì)、來源選擇分離模式，若無樣品信息可先選CZE。3.根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測方法。4.確定pH、緩沖試劑濃度。5.優(yōu)化其它操作參數(shù)，如毛細(xì)管尺寸、分離電壓、溫度等。6.確定是否需要使用添加