毛細管電泳分離技術(shù)

1、毛細管電泳分離技術(shù),,第一節(jié)　概　述,電泳是基于兩種或多種帶電粒子或微粒，它們所在的介質(zhì)受到外加直流電場的作用下，其遷移速率不同而得到分離的一類方法。（electrophoresis ）,發(fā)展歷程,1807年，F(xiàn)erdinand Frederic Reuss就觀察到了荷電物質(zhì)在電場力作用下會發(fā)生運動的現(xiàn)象。 1909年，由Michaelis對此現(xiàn)象的描述中提出電泳這個術(shù)語(elektron和pbore,分別代表電和搬運者的意思 )2

2、0世紀30年代，通過Tiselius的研究，電泳技術(shù)才得到有實際意義的發(fā)展，Tiseluis也因此獲得了1948年度的諾貝爾獎。 到20世紀50年代，電泳已經(jīng)是一種與紙和薄層的平面色譜技術(shù)一樣的實驗室常用技術(shù)。 20世紀70年代在HPLC的推動下，電泳分離技術(shù)成為了一種“灰姑娘”式的技術(shù),1981年，Jorgenson等介紹了毛細管區(qū)帶電泳技術(shù)。1984年Terabe等提出的膠束電動毛細管色譜。1987年，Hjerten建立了毛

3、細管等電聚焦。1987年，由Chohen等提出了毛細管凝膠電泳。1991年，Monnig等首次提出了高速毛細管電泳。目前，毛細管電泳已廣泛應(yīng)用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和核酸等離子型生物大分子的分離分析，加入表面活性劑還可以擴大到中性粒子，甚至應(yīng)用到細胞和病毒等的分離。同時，在小分子化合物的分離分析方面也取得了重大進展。,第二節(jié)　毛細管電泳基本原理,一、毛細管電泳的理論基礎(chǔ)毛細管電泳法：是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為

4、驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和/或分配行為的差異而實現(xiàn)分離的一種分析方法。在毛細管電泳中帶電粒子所受的驅(qū)動力： 電泳力 電滲力,,（一）電泳和電滲,電泳(Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子(離子、膠團)在電場中定向移動的現(xiàn)象。電泳是驅(qū)動電解質(zhì)運動的第一種動力。電泳遷移速度Ve :

5、 Ve= μeE = μeV/L 注：μe:電泳遷移率(電泳淌度); E:電場強度; V－毛細管柱兩端施加的電壓；L－毛細管柱的長度。 μe =νe/E= Q/f,,當(dāng)毛細管長度一定時，帶電離子的遷移速度與溶質(zhì)離子的電荷、施加的電壓、緩沖溶液的粘度及帶電離子的大小有關(guān)。,,注： Q－離子所帶的凈電荷；f－Stokes阻力系數(shù)。η是緩沖溶液的粘度(動力學(xué)的)，Rs是離子的有效半徑

6、(包括溶劑化層),電滲(Electro osmosis)是驅(qū)動電解質(zhì)運動的第二種作用力，它使毛細管中的溶劑在直流電場作用下發(fā)生定向運動。,電滲流的產(chǎn)生,毛細管內(nèi)壁表面上的硅醇基在pH>3的水溶液中，可電離而產(chǎn)生SiO-負離子，使毛細管內(nèi)壁帶上負電荷，因此，溶液中的一部分正離子就靠靜電作用而吸附于毛細管內(nèi)壁上，形成一個雙電層(Electric double layer)。其中一層是帶負電的內(nèi)壁，一層是帶正電的溶液離子吸附層。但溶液中

7、的其余大部分正離子則是離內(nèi)壁越遠，越呈自由狀態(tài)，于是在吸附層之外又存在著一個擴散層 。,固、液兩相之間的相對運動發(fā)生在吸附層與擴散層之間的滑動面上，此處的電動勢稱為界面電動勢，也稱ζ電位。由于處在擴散層中的正離子的溶劑化作用，它在電場中發(fā)生遷移時，將帶動整個溶液向陰極移動，所以就形成電滲流（Electro Osmotic Flow, EOF）。,電滲流速度Veo與ζ電位、ε、E成正比，而與介質(zhì)的粘度η成反比。,,,電滲流遷移率,介質(zhì)

8、的介電常數(shù),界面電動勢,介質(zhì)的粘度,溶劑流遷移速度,與HPLC柱不同，毛細管中的電滲流呈平面流型，它不存在徑向梯度。,電滲流的意義,電泳過程中伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快5-7倍利用電滲流可將正、負離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時完成正、負離子的分離分析。,電解質(zhì)區(qū)帶的移動速度(Vi)等于電解質(zhì)區(qū)帶的電泳遷移速度(Ve)與溶劑流速度(Veo)之和。,Vi = Ve + Veo,當(dāng)把樣品從陽極

9、端注入毛細管時，假設(shè)A物質(zhì)為負離子，B物質(zhì)為正離子，則帶不同電荷的離子將按下面的速度遷移到陰極，到時間t時，A、B物質(zhì)已經(jīng)分離了。 正離子：νt =νeo + ν+ 中性分子：νt = νeo 負離子：νt =νeo - νˉ,注：電滲流的速度為泳流的若5-7倍,抑制毛細管中電滲流的辦法：消除固液界面間的ζ電位或提高溶液的粘度；在毛細管的內(nèi)壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂層。 具體方法有：,電滲流是毛細管電泳

10、分離的重要參數(shù)，控制電滲流的大小和方向，可提高毛細管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度,(二)分離效率和分離度,1、分離效率柱效可用理論塔板數(shù)n表示,,理論塔板高,毛細管電泳分離柱效方程式,實驗上可按下式求出理論塔板數(shù),毛細管有效長度,毛細管總長度,兩端電壓,溶質(zhì)擴散系數(shù),電泳湍度,電滲湍度,電泳圖上從起點至電泳峰最大值之間的距離,電泳峰的半高峰寬,,提高分離電壓是增加分離效率的主要途徑，在相同的操作電壓下，l/L =1，分離效率最高（短

11、的毛細管）。此外，N與溶質(zhì)的擴散系數(shù)D成反比，所以用毛細管電泳分離大分子時，可得到高的柱效。 高的電滲流也可提高柱效。,毛細管電泳分離柱效方程式,2、分離度電泳中兩峰的分離度，也稱分辨率，它表明湍度相近的組分分開的能力，可表達為（和哪些因素有關(guān)）：,,柱效,相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差,兩者的平均速度,表示分離的選擇性,分離度計算式（具體如何計算）:,組分遷移時間,峰底寬度,（三）區(qū)帶寬度及展寬因素,1、各組分都有相近的空間寬度毛細管電

12、泳里有電滲流，泳動是平頭的，幾乎不擴散，不管什么時間測峰，區(qū)帶寬度幾乎是相等的，這跟液相色譜是不一樣的。,2、區(qū)帶寬度展寬因素,毛細管電泳分離中，各組分區(qū)帶因各自的電遷移速度不同而被分離，同時在遷移過程中也會發(fā)生區(qū)帶展寬，影響遷移速度相近物質(zhì)間的分離。,焦耳熱,進樣,電泳擴散,毛細管壁對組分的吸附,,,,,,,,,,,,,,,（4）電泳擴散 試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細管其它地方的濃度或電阻

13、率不相等時，因兩個區(qū)域電場強度的差異，而引起區(qū)帶分散。,二、毛細管電泳的分離模式,毛細管區(qū)帶電泳(CZE) 膠束電動毛細管電泳(MECC) 毛細管凝膠電泳(CGE) 毛細管等電聚焦(CIEF) 毛細管等速電泳(CITP) 毛細管離子電泳(CIE) 毛細管電色譜,,原理,分離過程,1、毛細管區(qū)帶電泳(CZE),毛細管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE) 是毛細管電泳中最基本的

14、操作模式，應(yīng)用最廣泛，是其它操作模式的母體。分離原理：由于各組分間荷質(zhì)比的差異，混合組分處在背景電解質(zhì)溶液中，在外加電場作用下便獲得分離，即CZE是基于溶質(zhì)的湍度差異進行分離的。,2、膠束電動毛細管電泳(MECC),膠束電動毛細管電泳（micellar eletrokinetic capillary chromatography,MECC）是以膠束為假定固定相的一種電動色譜，是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的結(jié)合。它是在電泳緩沖溶液中加入高于膠

15、束臨界濃度（CMC）的表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），其疏水基團聚集形成膠束，基于各組分溶質(zhì)在水相和膠束之間的分配系數(shù)不同，而獲得分離。不僅能分離離子化合物，還能分離中性化合物。,分離過程：在電場作用下，體相溶液在EOF帶動下流向陰極，表面帶負電荷的膠束泳動方向與EOF方向相反，一般EOF速度大于膠束泳動速度，因此膠束凈遷移向陰極。溶質(zhì)在流速大的體相水溶液和流速相對較緩慢的假固定相膠束間進行分配。,3、毛細管凝膠電泳(CGE)

16、,毛細管凝膠電泳：它是用多孔性的凝膠或其他篩分劑作介質(zhì)，因凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)類似于分子篩的作用，流經(jīng)凝膠的試樣，按分子的大小分離。,篩分劑,凝膠材料：化學(xué)共價或交聯(lián)方式形成的膠狀多孔物質(zhì)，成型后很難改變。 聚丙烯酰胺凝膠 葡聚糖凝膠 瓊脂糖凝膠非凝膠材料：纏繞的聚合物以物理方式組成的物質(zhì)，較易隨容器不同改變形狀。 甲基纖維素,,,優(yōu)點：1、毛細

17、管凝膠電泳分離度極高。電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的結(jié)合。 2、電泳峰尖銳，柱效極高。凝膠黏度大，抗對流，溶質(zhì)擴散減少，限制了譜帶展寬。 3、組分在短柱上能有極好的分離。溶質(zhì)與凝膠可形成絡(luò)合物，增加了分離度，防止了 溶質(zhì)在毛細管壁的吸附，減少了電滲流。缺點: 制備柱較困難，壽命較短。,毛細管凝膠電泳優(yōu)缺點,4、毛細管等電聚焦(CIEF),CIEF：是建立在不同蛋白

18、質(zhì)或多肽之間等電點差異基礎(chǔ)上的分離方法。分離兩性電解質(zhì)，分辨率高（區(qū)分0.01 pH ）。蛋白質(zhì)的等電點（PI）：指蛋白質(zhì)的分子的表觀電荷數(shù)為零時的pH值。 方法是按進樣——等電聚焦——檢測三步進行,蛋白質(zhì)與兩性溶液混合進樣,蛋白質(zhì)與兩性溶液混合進樣,1、施加電壓，兩性電解質(zhì)遷移，在毛細管柱中形成pH梯度2、被分離物質(zhì)遷移至其等電點的pH區(qū)域，停止移動,注意：電滲流的存在會破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶。解決方法：通過管壁涂層使電滲流減

19、少到最小，可防止蛋白質(zhì)吸附及破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶。,第三節(jié)　毛細管電泳裝置,直流高壓電源、毛細管、進樣裝置、檢測器和記錄儀等,高壓電源可對毛細管施加5~50 kV電壓，操作電壓一般控制在5~30 kV范圍。 CE通常使用內(nèi)徑10~100 μm、長12~120 cm (內(nèi)涂聚酰亞胺) 彈性融凝石英毛細管，毛細管的兩端分別浸泡在含有緩沖溶液的貯液槽中，毛細管內(nèi)也充滿同樣的緩沖溶液。 被分離試樣可以采用流體動力學(xué)進樣和電動進樣方式由毛細管一

20、端進入。,一、毛細管電泳的進樣技術(shù),毛細管內(nèi)徑小于100μm時，注射器進樣比較困難。（一）電動進樣（二）流體動力學(xué)進樣,（一）電動進樣,三 步：毛細管的進樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測段的緩沖液間施加進樣電壓，并維持一定時間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進入毛細管，然后再將試樣溶液換成緩沖液，電泳即可進行。改變進樣電壓和進樣時間，便可改變進樣量。,（二）流體動力學(xué)進樣,流體動力學(xué)進樣：也稱虹吸進樣

21、、重力進樣和壓差進樣。將毛細管插入試樣溶液容器，通過進樣端加壓，或調(diào)節(jié)進樣端試樣溶液液面高于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現(xiàn)象，試樣在壓力差作用下進入毛細管進樣端，再把進樣端放回緩沖液液槽中，進行電泳。,二、毛細管電泳檢測器,由于樣品區(qū)帶在高壓電場作用下，遷移速度較快，因此，CE要求所用的檢測器必須具有很快的響應(yīng)速度和很高的靈敏度。 光學(xué)檢測器（紫外檢測器和熒光檢測器）電化學(xué)檢測器質(zhì)譜檢測器核磁共振檢測器,紫外檢測器,根據(jù)比耳

22、定律，光度測量值A(chǔ)與吸收光程成正比。一般檢測中，檢測最大光程是用毛細管內(nèi)徑，而毛細管內(nèi)徑增大受焦耳熱影響的制約，因此采用細內(nèi)徑毛細管柱時，測量靈敏度受到限制。,第四節(jié)　毛細管電泳技術(shù)的應(yīng)用研究進展,毛細管電泳技術(shù)的應(yīng)用,（一）糖類的分離與分析 （二）在天然中草藥分析領(lǐng)域中的應(yīng)用（三）在基因工程研究方面的應(yīng)用（四）單細胞分析（五）手性分離（六）小分子離子分析,思考題,理解電泳、電滲、電滲流、電泳淌度等幾個基本概念。簡述影響電