李若瑜藥敏試驗

1、臨床常見病原真菌耐藥監(jiān)測,北京大學第一醫(yī)院皮膚科北京大學真菌和真菌病研究中心李若瑜,第16期國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目（2015），《皮膚真菌病基礎和臨床研究進展講習班》,內(nèi) 容,藥敏試驗的常用方法及應用抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測現(xiàn)狀抗真菌藥物的耐藥機制研究近況,,,,抗真菌藥物的種類,麥角固醇,多烯類如 兩性霉素 B,唑類如 氟康唑伊曲康唑伏立康唑泊沙康唑,核苷類如 5-氟胞嘧啶,角鯊烯,羊毛甾醇,K+Mg 2+,丙烯胺

2、類如 特比萘芬,乙酰輔酶A,棘白菌素 類如 卡泊芬凈 米卡芬凈 安尼芬凈,,尼可霉素,,,,核酸合成,葡聚糖合成,甲殼質(zhì)合成,侵襲性真菌感染逐漸增多,念珠菌－院內(nèi)感染第４位的病原菌曲霉－第2位的病原真菌接合菌(毛霉)隱球菌,臨床有增多趨勢的條件性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染鐮刀菌感染枝頂孢霉感染暗色真菌感染馬爾尼菲青霉,真菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)...,耐氟康唑的白念珠菌 耐伊曲康唑

3、、伏立康唑以及泊沙康唑的絲狀真菌 耐兩性霉素B絲狀真菌 耐卡泊芬凈的念珠菌株,藥敏試驗的作用,評價新型抗真菌藥物的體外抗菌活性，開發(fā)新藥;檢測臨床病原真菌對不同抗真菌藥物的體外敏感性;指導臨床用藥的選擇, 監(jiān)測療效,發(fā)現(xiàn)耐藥株.,藥敏試驗測定方法,液基稀釋法—CLSI M27-A3，M38-A2瓊脂稀釋法紙片擴散法—CLSI M44-A2E－test法, ATB Fungus2,3聯(lián)合用藥：棋盤法棘白菌素類,標準化

4、的藥敏方法日趨成熟,CLSI （NCCLS)制定的標準被普遍接受M27－A3 酵母菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥敏試驗參考方法 _棘白菌素類折點M38－A2絲狀真菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥敏試驗參考方法 _新質(zhì)控株、皮膚癬菌M44－A2酵母菌紙片擴散法抗真菌藥敏試驗EUCAST標準（European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing）與CLSI取得一致,酵母菌藥敏試驗,建立了

5、對以下藥物的測定方法: 氟康唑、伊曲康唑、 5-FC、兩性霉素B、伏立康唑;體外-體內(nèi)療效關(guān)系已初步建立,特別對氟康唑;已提出判定折點及其解釋.,絲狀真菌藥敏試驗,產(chǎn)孢菌種已建立方法;針對目前臨床常用藥物(棘白菌素);但尚未建立折點;體外–體內(nèi)的一致性尚在探討中;檢測煙曲霉菌 對唑類藥物的敏感性有意義; 兩性霉素B 解釋仍然困難;詳細鑒定到種水平是必要的;如土曲霉, 尖端賽多孢子菌, 和多育賽多孢一般對兩性霉素

6、B 耐藥.,Etest和其它商品化方法,優(yōu)點: 使用簡便；對酵母菌比較穩(wěn)定, 絲狀菌尚在研究中；與CLSI方法有較高一致性；但對唑類的MICs 常由于存在拖尾難以判斷；其它的快速檢測試劑尚需進一步驗證, 如ROSCO紙片法。,判斷抗真菌藥的敏感性和耐藥性,CLSI方案測定念珠菌體外敏感試驗折點,*數(shù)據(jù)主要基于粘膜疾病,M-44A方案測定念珠菌體外敏感試驗折點,藥敏試驗的應用指征,盡可能將臨床分離株鑒定到種； 意義：曲霉

7、中敏感性不同，土曲、新種↓無菌部位的念珠菌，常規(guī)做氟康唑和 5-FC藥敏；黏膜感染，治療失敗后應行藥敏；天然耐藥者不測.,內(nèi) 容,藥敏試驗的常用方法及應用抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測現(xiàn)狀抗真菌藥物的耐藥機制研究近況,ARTEMIS DISK藥敏監(jiān)測—來自全球40個國家134個研究點,氟康唑:205,329株酵母菌(1997至2005)；伏立康唑:147,776株酵母菌(2001至2005)；方法：CLSI M44-A紙片

8、擴散法結(jié)果：BIOMIC圖象分析系統(tǒng)自動判讀。,Pfaller et al. J Clin Microbiol 2007, Vol.45, P.1735-45,ARTEMIS DISK 監(jiān)測結(jié)果,90.1%的念珠菌株對氟康唑敏感，22個種中有10個種出現(xiàn)敏感性降低(敏感度<75% )，對氟康唑耐藥的種主要為光滑念珠菌和克柔念珠菌。94.8%的念珠菌對伏立康唑敏感，3.1%耐藥。對氟康唑耐藥的白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌和皺

9、落念珠菌菌株中對伏立康唑保持敏感的比例不足30% 。非念珠菌酵母菌(8,821 株)，對氟康唑不敏感，除紅酵母菌對伏立康唑敏感。本研究證實了唑類藥物對臨床最常見酵母菌的廣譜抗菌活性，但也發(fā)現(xiàn)一些少見酵母菌的敏感性下降。,Pfaller et al. J Clin Microbiol 2007, Vol.45, P.1735-45,念珠菌血癥病原菌的藥敏,China-Scan項目：2009年11月至2011年4月，全國63家醫(yī)院67個

10、ICU病房共同參加，249例念珠菌血癥了解我國ICU患者中侵襲性念珠菌血癥病原菌的體外藥物敏感性特征,判斷抗真菌藥的敏感性和耐藥性,*數(shù)據(jù)主要基于粘膜疾病,The CLSI breakpoint for echinocandins=2 µg/ml,藥敏試驗結(jié)果（MIC90）,%,%,μg/ml,%,,Fluconazole不敏感念珠菌對Voriconazole的藥敏數(shù)據(jù),Pfaller MA, JCM, 2010,48(4

11、): 1366–1377,唑類交叉耐藥比例升高,全球念珠菌監(jiān)測體外藥敏數(shù)據(jù)(1997-2007),荷蘭伊曲康唑耐藥菌比例有所上升,Year,% R,N,Snelders et al. PLoS Medicine. 2008;5:e219.,L98H (TR) was the dominant resistance mechanismIsolates genetically distinct but clustered.,曲霉臨床菌株的

12、分離鑒定,來源：北大醫(yī)院皮科真菌室受檢標本時間：2008年7月到2011年11月 鑒定：所有菌株均經(jīng)標準的曲霉鑒定方法進行鑒定，即在麥芽瓊脂和查氏瓊脂平皿25度培養(yǎng)7天后，經(jīng)形態(tài)學鑒定（據(jù)齊祖同主編《中國真菌志-第5卷：曲霉屬及其相關(guān)有性型》，科學出版社，1997年）菌種分布：煙曲霉130株，黃曲霉58株，土曲霉16株，其它9株,藥物敏感性測定及結(jié)果,測定方法：CLSI M38-A方案和E-試驗結(jié)果1株煙曲霉對ITC耐藥而對V

13、RC敏感1株煙曲霉對ITC和VRC均耐藥1株黃曲霉對VRC耐藥而對ITC敏感,內(nèi) 容,藥敏試驗的常用方法及應用抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測現(xiàn)狀抗真菌藥物的耐藥機制研究近況,什么情況下容易發(fā)生耐藥?,P.Verweij, TIMM, 2007,常見耐藥菌及其類型,ERG11基因突變ERG11基因過表達ERG3、ERG5基因突變藥物泵基因過表達,念珠菌唑類藥物耐藥機制,Clin Microbiol Rev 1998; 11: 382,

14、煙曲霉菌耐藥機制,Chamilos G, Kontoyiannis DP., Drug Resistance Updates 8 (2005) 344–358,,AF1，2001年12月，第一次就診； AF2，2002年6月，ICZ 200mg/d治療6個月后； AF3，2002年8月，停藥2個月以后；ICZ靜脈給藥，200mg bid治療兩周，然后口服，200mg/d繼續(xù)治療，其間分離到以下三株： AF4，2002年12

15、月； AF5，2003年1月； AF6，2003年2月；,煙曲霉唑類藥物耐藥系列分離株,Chen & Li,et al. JAC, 2005.,MIC of itraconazole against 6 isolates,AF2的CYP51A第220位蛋氨酸被異亮氨酸替代(M220I),AF4-6的CYP51A第54位的甘氨酸被精氨酸替代(G54R),藥物流出泵及唑類藥物靶酶基因相對表達水平,Mann P. A, et a

16、l .Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 577-581.Diaz-Guerra T. M,et al. Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 1120-1124 Nascimento A. M,et al. Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 1719-1726Mellado E. et al. Antim

17、icrob. Agents Chemother, 2004,48: 2747-2750,煙曲霉菌 cyp51A 基因突變的報道,有關(guān)三唑類耐藥的氨基酸替換,,,﹡許多三唑類耐藥是因為在 CYP51A 基因啟動子 L89H 與2個拷貝的34 bp片段串聯(lián)相結(jié)合。,藥物主動外排泵的變化,Update on azole resistance in Aspergillus fumigatus,曲霉與唑類,In vitro “reduced su

18、sceptibility” remains 0-5% in most large surveys, often using itraconazoleMost data for A. fumigatus sectionCase reports and case series suggest that multiply-azole resistant Aspergillus could emerge? association with

19、 agricultural azole use,Rodriguez-Tudela, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52:2468.Verweij, et al. N Engl J Med. 2007;356:1481-83.Arendrup, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52:3504-11.Howard, et al. In

20、t J Antimicrob Agents Chemother. 2006;28:450-53.Snelders et al. PLoS Medicine. 2008;5:e219.,唑類藥物對曲霉的流行病學折點,Espinel-Ingroff et al. JCM. 2010; submitted.,Development of Azole resistance of A. fumigatus,P.Verweij, TIMM, 20

21、07,耐藥曲霉感染的病例報告（1）,女性，10歲，急淋，在化療過程中出現(xiàn)高熱；給予頭孢匹胺等抗細菌、氟康唑預防真菌感染處理；肺部CT檢示：肺內(nèi)結(jié)節(jié)灶；痰液真菌鏡檢示：分支分隔的菌絲，培養(yǎng)示煙曲霉，故改用伏立康唑；治療9天后，體溫38.1度，咳嗽減輕；繼續(xù)治療一周后復查CT見肺臟病變減輕不明顯，故而給予AMB，20mg/d，一周后無發(fā)熱、咳嗽，肺內(nèi)病變未擴大；繼續(xù)治療一周后無明顯癥狀，CT示肺內(nèi)結(jié)節(jié)局限，故停用AMB而出院。,臨床

22、菌株及藥物敏感性特點（1）,煙曲霉唑類藥物耐藥機制（2）,未見以往的G54、M220、G448、G138（后二者與ITC及VRC交叉耐藥相關(guān)）Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E:文獻報告與耐藥無關(guān)TR/L98H: 導致ITC耐藥、VRC中度敏感；故L190P與耐藥無關(guān)，而L307P的作用需闡明 Qiao, 2008；Mellado, 2007；Howard,2006； Kontoyiannis, 2005；