真菌感染與實驗室診斷進展李若瑜

1、全國基層醫(yī)療機構(gòu)抗菌藥物合理應(yīng)用,培訓(xùn)項目,常見病原真菌,李若瑜北京大學(xué)第一醫(yī)院北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心,真菌感染的分類——,根據(jù)真菌侵犯人體的部位分為四類：淺表真菌病皮膚真菌病 皮下組織真菌病系統(tǒng)性真菌病,,,,,淺部真菌病,深部真菌病,臨床常見的真菌病——,淺表真菌?。夯ò甙_掌黑癬毛結(jié)節(jié)菌病,皮膚真菌?。浩つw癬菌病 —手足、體股、頭、甲皮膚念珠菌病,皮下真菌?。烘咦咏z菌病著色芽生

2、菌病暗色絲孢霉病足菌腫,系統(tǒng)性真菌?。耗钪榫∏共‰[球菌病接合菌病雙相真菌感染,淺部真菌病,限于皮膚最外層，甲板、毛發(fā)和粘膜的感染。主要的感染是皮膚癬菌病和淺表念珠菌病。大多輕微，容易診斷，對治療反應(yīng)良好。,手、足、甲癬—最常見的真菌病,各種頭癬：傳染、危害健康,皮下真菌病—往往經(jīng)過外傷發(fā)病,孢子絲菌病,著色芽生菌病,系統(tǒng)性真菌病,常起源于肺，可以播散到全身許多器官。常通過吸入致病菌孢子而獲得，其致病菌腐生于土壤或

3、腐敗有機物中，或作為植物致病菌。病原體可分為兩組：真正的致病菌和條件致病菌。,系統(tǒng)性真菌病—危及生命,系統(tǒng)性真菌病主要的致病真菌,莢膜組織胞漿菌粗球孢子菌皮炎芽生菌巴西副球孢子菌,臨床常見的條件性真菌感染,念珠菌病: 最常見，血源感染的第4位。曲霉菌病: 常見于干細胞移植、實體器官移植、大劑量化療患者。隱球菌病: 艾滋病人患病率為10-20%。 接合菌病（毛霉病）:多見于重癥糖尿病、燒傷病及器官移植病人。,臨床有增多趨勢的

4、條件性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染鐮刀菌感染枝頂孢霉感染暗色真菌感染馬爾尼菲青霉,真菌感染的診斷方法,真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學(xué)方法分子生物學(xué),真菌感染的實驗診斷方法及問題,顯微鏡檢查-陽性率？培養(yǎng)-時間？敏感性？意義？血清學(xué)-敏感性？特異性？分子生物學(xué)-標準化？,,組織病理學(xué),阿申藍染色,H&E,PAS,組織學(xué)特點,Immunochemistry,皮膚隱球菌病的組織病

5、理學(xué),菌絲 孢子曲霉病的組織病理學(xué),,,,Prof. Richardd Calderone’s lecture-2006, Beijing,念珠菌病-直接鏡檢,隱球菌病—直接鏡檢,曲霉病——,曲霉頭,曲霉病,雙分支菌絲,曲霉病——直接鏡檢,雙分支菌絲,曲霉頭,接合菌（毛霉）病—直接鏡檢,粗大無分隔菌絲,各種培養(yǎng)法—,病原真菌鑒定的基本流程,臨床標本,,PDA, SDA28度培養(yǎng),,,,,,不能生長,鼻

6、孢子菌、肺孢子菌、馬拉色菌（厚皮除外）,,,,,,芽孢,關(guān)節(jié)孢子,念珠菌、隱球菌、紅酵母等,毛孢子菌、地霉等,,,,,有隔菌絲,無隔菌絲,擔(dān)子菌、子囊菌、半知菌,接合菌等,常見病原真菌,酵母及酵母樣真菌_念珠菌_隱球菌_毛孢子菌_馬拉色菌,霉菌(絲狀真菌)_皮膚癬菌_曲霉_毛霉_鐮刀菌等,雙相真菌,念 珠 菌 屬,簡介,念珠菌大約有150個種，65%以上不能在37℃生長，無致病性念珠菌屬可以感染皮膚、粘膜及內(nèi)臟器官引起

7、念珠菌病常見的致病性念珠菌白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌臨床最常見的是白念珠菌,生物學(xué)特性,念珠菌在環(huán)境中和人體內(nèi)均可寄生存在 正常人皮膚、口腔、腸道、肛門、陰道中可分離出本菌 顯微鏡下表現(xiàn)為芽孢和假菌絲假菌絲一般與致病相關(guān)寄生時一般表現(xiàn)為孢子相,致病性,條件致病菌 白念珠菌致病力強 念珠菌毒素、菌體形態(tài)、黏附性和分泌水解酶與其致病性密切相關(guān),常見病原菌,白念珠

8、菌（Candida albicans）熱帶念珠菌（C.tropicalis）克柔念珠菌（C.krusei）近平滑念珠菌（C.parapsilosis)光滑念珠菌 (C.glabrata)乳酒念珠菌（C.kefyr）季也蒙念珠菌（C.guilliermondii）,實驗室檢查,直接鏡檢：可見卵園形發(fā)芽孢子及菌絲，如查到大量假菌絲，說明念珠菌處于致病狀態(tài)。染色：革蘭氏染色，菌絲、芽孢呈藍色，著色不均勻。過碘酸染色，菌絲、芽孢染

9、成紅色。用1:1000吖啶橙染色，在熒光顯微鏡下，菌體呈現(xiàn)熒光。培養(yǎng)：最常用的培養(yǎng)基是沙堡氏培基，當(dāng)菌落生長后再移種至米粉吐溫80培基或其它鑒定培養(yǎng)基中，以便進一步鑒定菌種。,念珠菌直接鏡檢（LPCB）,假菌絲和芽孢,致病性酵母菌鑒定原則,鑒定目的：確定感染及傳染源；選擇敏感抗真菌藥物；哪些酵母菌需要鑒定到種：所有分離自無菌體液，包括腦脊液、血液、尿液、穿刺液及其它體液的酵母菌；分離自所有嚴重疾患或免疫受損病人或懷疑真菌感染的病

10、人的酵母菌；從任何臨床標本中分離出大量的酵母菌；分自若干連續(xù)取材的標本，除呼吸道分泌物，也應(yīng)鑒定至種的水平；,芽管試驗（Germ-tube test）,原理：白念珠菌在有營養(yǎng)的液體環(huán)境中35℃培養(yǎng)，可從酵母細胞生出芽管。結(jié)果：白念珠菌可在2h內(nèi)生成芽管，熱帶念珠菌和其他念珠菌則否。,厚膜孢子形成試驗（Dalmo plate test）,念珠菌顯色培養(yǎng)基CHROMagar Candida,API—20C酵母鑒定系統(tǒng),ID32C

11、 酵母鑒定系統(tǒng),VITEK全自動微生物鑒定儀,YBC酵母菌鑒定卡。有30個孔的一次性塑料卡，包括26個常規(guī)生化反應(yīng)和4個陰性質(zhì)控。利用YBC，只有21.3%的酵母需做補充生化試驗或形態(tài)學(xué)檢查。,白念珠菌,菌落特征 沙氏培養(yǎng)基25℃中等速度生長，形成酵母樣菌落，奶油樣、光滑、閃光，老后有皺褶顯色瓊脂基上呈綠色菌落 顯微鏡特征 玉米粉吐溫瓊脂：真菌絲和假菌絲，多數(shù)假菌絲，假菌絲連接處產(chǎn)生多數(shù)呈簇狀、葡萄狀小分生孢子，頂端或側(cè)支

12、產(chǎn)生厚壁孢子血清芽管試驗，在37℃1-3小時后，可以產(chǎn)生芽管,白念珠菌(Candida albicans),酵母菌鑒定程序和路線,酵母純培養(yǎng)  玉米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基(25℃)‘  假菌絲（+）

13、 假菌絲（-） 厚壁孢子（+） 厚壁孢子（-） 尿素酶試驗（+） 尿素酶試驗（-） 白念珠菌 光滑念珠菌 關(guān)節(jié)孢子

14、（+） 關(guān)節(jié)孢子（-） 酵母屬 芽孢（+） 菌落無胡蘿卜色 菌落呈胡蘿卜色 芽孢（+） 芽孢（-） 念珠菌屬 紅酵母屬

15、 絲孢酵母屬 地霉菌屬 咖啡酸試驗 有棕色色素

16、 無棕色色素 新生隱球菌 隱球菌屬,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,血清學(xué)試驗-菌種鑒定,抗原型別： —因子血清（CANDIDA CHECK）：九種因子+蔗糖分解，鑒別7種致病性念珠菌； —因子血清（CRYPTO CHECK）：八種因子，可鑒別8種隱球菌及變種,分子生物學(xué)

17、方法,1.5hrs,3hrs,2.5hrs,4.5hrs,5.5hrs,,,,,,,小結(jié)—酵母菌鑒定依據(jù),傳統(tǒng)菌落顏色、外觀鏡下細胞形態(tài)、大小有無莢膜有無假菌絲和菌絲芽管形成和厚膜孢子形成碳源同化、發(fā)酵氮源同化、發(fā)酵,現(xiàn)代 輔酶Q系統(tǒng) 同功酶 血清學(xué) 基因分型技術(shù),敏感藥物與耐藥性,兩性霉素B唑類抗真菌藥物 (除光滑和克柔念珠菌外,大多數(shù)對氟康唑敏感.長期用藥有可能出現(xiàn)耐藥)棘白菌素類藥物,隱 球 菌,,隱球菌

18、屬(Cryptococcus)特點,本屬的共同特征為細胞呈圓形或卵圓形，偶有伸長形或多樣形，呈多邊芽殖。大部分菌株有莢膜。所有菌種都能同化肌醇并在碳源中生長。糖發(fā)酵（—）在固體培養(yǎng)基中，大部分菌種呈粘液狀，無假菌絲或假菌絲發(fā)育不全。不產(chǎn)生子囊孢子。冬孢子或擲孢子。新生隱球菌有性期：屬擔(dān)子菌，新生線黑粉菌,臨床常見的隱球菌,Lodder1970年記載隱球菌：17種，6變種。主要致病菌種：新生隱球菌新生隱球菌新生變種新生隱

19、球菌格替變種C.neoformans var. grubii淺黃隱球菌淺白隱球菌羅倫隱球菌,致病性隱球菌,新生隱球菌(C. neoformans)三個變種 新生隱球菌新生變種（C.neoformans var. neoformans）格特變種（C.neoformans var.gatii）C.neoformans var. grubii,血清學(xué)分類,A、B、C、D及AD型新生變種-D型grubii變種-A型格特變種

20、-B、C型,致病性,呼吸道進入體內(nèi)健康人具有免疫能力 易感因素AIDS、糖尿病、淋巴瘤、晚期腫瘤、SLE、器官移植,隱球菌病cryptococcosis,是由隱球菌屬中某些種或變種引起的一種深部真菌病。 主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng), 預(yù)后嚴重, 死亡率高, 也可侵犯肺部、皮膚、骨骼等其它臟器。近年來免疫力降低的病人逐年增多, 本病發(fā)病率也呈上升趨勢, 特別是在愛滋病病人已成為死亡的主要原因之一。,生物學(xué)性狀,在SDA培養(yǎng)基上25℃培

21、養(yǎng)2-5天，可以見到奶油色酵母樣菌落，有時黃色或帶粉色顯微鏡下可見到球形或橢圓形酵母細胞，直徑2-5μm，第一代培養(yǎng)物有時可見小的莢膜，繼代培養(yǎng)不見莢膜腦脊液直接涂片，細胞有較寬的莢膜。顯微鏡下有時可見到出芽現(xiàn)象,實驗室檢查-病原學(xué)檢查,直接鏡檢: 墨汁染色，新生隱球菌呈圓形或橢圓形的雙層厚壁孢子, 外有一層寬闊莢膜, 邊緣清楚完整, 菌體內(nèi)可見出芽（菌體計數(shù)：判斷預(yù)后及療效的指標）培養(yǎng)：培養(yǎng)基內(nèi)可加氯霉素, 但不可加放線菌酮,

22、 因后者抑制本菌生長。生理生化測定：采用自動微生物系統(tǒng)和API鑒定組織病理學(xué)檢查及免疫組化,直接鏡檢,腦脊液直接墨汁涂片,,真菌培養(yǎng),SDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng),,實驗室檢查-其它檢查方法,腦脊液檢查： 中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病腦脊液壓力增高, 外觀正?；蛭⒒? 白細胞數(shù)增多, 早期以中性粒細胞為主, 中后期以淋巴細胞為主。糖和氯化物在早期變化不明顯, 中后期可明顯減少。蛋白含量在中后期增高?？乖瓩z查： 乳膠凝集試驗檢測腦脊液及其它

23、體液標本中新生隱球菌莢膜多糖抗原可簡便快速有效診斷隱球菌性腦膜炎,乳膠凝集試驗,陰性,陽性,新生隱球菌(Cryptococcus neoformans),主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可侵及肺、骨、皮膚，甚至引起敗血癥。肺是新生隱球菌侵入的主要途徑，肺隱球菌病也是隱球菌病的最早表現(xiàn)。該菌的特異性檢查為，墨汁涂片，鏡下可見圓形或卵圓形厚壁孢子，直徑2.5-20um，單芽，也可多芽。菌體外圍有一圈透光的莢膜，厚度幾乎與菌體相等甚至大于菌

24、體。孢子內(nèi)有反光顆粒。尿素酶試驗陽性。,新生隱球菌(Cryptococcus neoformans),直接鏡檢（墨汁染色）,咖啡酸瓊脂產(chǎn)生棕色菌落,敏感藥物,兩性霉素B5-氟胞嘧啶 (與兩性霉素B聯(lián)合用藥)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等唑類藥物多用于維持治療或兩性霉素B不耐受的病例。,曲 霉,菌屬分類,曲霉是一類絲狀真菌，在自然界中廣泛存在。曲霉屬的有性階段屬于子囊菌門、不整子囊菌綱、散囊菌目、散囊菌科、散囊菌屬、裸孢殼屬和

25、薩托菌屬；有性期僅在部分曲霉有描述。無性階段屬半知菌、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科。,菌屬分類,煙曲霉（A. fumigatus）是最常見的致病曲霉其次為黃曲霉（A. flavus）和黑曲霉（A. niger）棒曲霉（A. clavatus）、灰綠曲霉（A. glaucus）、構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）、米曲霉（A. oryzae）、土曲霉（A. terreus）、焦曲霉（A. ustus）、雜色曲霉（A. versicol

26、or）也有致病報道，但發(fā)生率低。,致病性,曲霉引起的人類疾病可分為3大類：機會性感染變態(tài)反應(yīng)性曲霉病真菌中毒免疫受損是曲霉機會性感染的最主要因素。,曲霉的菌落形態(tài),曲霉菌落呈絨毛狀或粉狀。大多數(shù)曲霉的培養(yǎng)基背面無色或淡黃色。構(gòu)巢曲霉培養(yǎng)基背面可以呈紫紅色、橄欖色；雜色曲霉背面則可呈桔黃色、紫紅色。,三種最常見人類致病性曲霉菌落形態(tài),煙曲霉,黃曲霉,黑曲霉,曲霉的主要形態(tài)特征,菌絲----分隔、分枝、無色/淡色/深色足細

27、胞----有分生孢子梗----分隔/不分隔,光滑/不光滑頂囊----燒瓶/半球產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)—瓶梗/瓶梗+?；稚咦印笮?、顏色、紋飾其它:子囊果、菌核等,曲霉的特殊結(jié)構(gòu),曲霉的特殊結(jié)構(gòu)包括：閉囊殼（cleistothecia）殼細胞（Hulle cells）粉孢子（aleuriconidia）菌核（sclerotia）,煙曲霉,黃曲霉,黑曲霉,三種最常見人類致病性曲霉鏡下形態(tài),敏感藥物與耐藥性,可選用兩性霉素B、伏立康唑

28、、伊曲康唑、卡泊芬凈和米卡芬凈。近年來，耐伊曲康唑的煙曲霉報道增多，而且出現(xiàn)多藥耐藥的煙曲霉臨床分離株。對兩性霉素B耐藥的黃曲霉臨床分離株也有報道。土曲霉對兩性霉素B天然耐藥。構(gòu)巢曲霉對兩性霉素B也常常耐藥。,接合菌(Zygomycetes),生物學(xué)特性及致病性,接合菌的主要特征為無性型在孢子囊內(nèi)形成不能游動的靜孢子，有性型形成接合孢子接合菌綱中只有毛霉目和蟲霉目兩個目的部分種可以致病。由毛霉目的菌引起的病稱毛霉?。∕ucormy

29、cosis），毛霉目和蟲霉目引起的病合稱為接合菌病。,毛霉目的分類位置,真菌界 (fungus kingdom) 接合菌門 (zygomycota) 接合菌綱 (zygomycetes) 毛霉目 (mucorales) 　犁頭霉屬、根霉屬、根

30、 毛霉屬、毛霉屬,與醫(yī)學(xué)關(guān)系,在毛霉目中已知可引起毛霉病有8科12屬24種左右由毛霉目的菌引起的病稱毛霉病，由毛霉目和蟲霉目引起的病稱接合菌病，亦稱藻狀菌病,毛霉病(mucormycosis)概述,是由毛霉目中某些菌種引起人類的一種感染性疾病, 一般呈急性快速發(fā)展, 少數(shù)為慢性發(fā)展?？衫奂氨?、腦、肺、胃腸道、皮膚等器官，其共同特征是血管壁破壞，血栓形成，周圍組織梗塞，產(chǎn)生黑色壞死性損害。大部分病人有嚴重的基礎(chǔ)疾病, 如糖

31、尿病、免疫抑制、饑餓、燒傷或其它嚴重的外傷。,診 斷,較困難, 特別是內(nèi)部器官感染, 常常是在尸檢中發(fā)現(xiàn)。毛霉為空氣的污染菌, 血、尿、腦脊液中罕見病原體生長, 血清學(xué)試驗和直接ELISA 試驗缺乏特異性, 常規(guī)化驗更無意義, 因此診斷困難。直接鏡檢標本中和組織病理切片中見到寬大無分隔或極少分隔菌絲, 比培養(yǎng)分離更有意義。真菌鏡檢陰性, 不能除外診斷。糖尿病患者, 有急性快速播散的鼻竇炎、眶組織蜂窩織炎、支氣管炎、支氣管或葉的肺炎

32、, 應(yīng)考慮毛霉病的診斷。,組織病理,直接鏡檢,可見粗大的、無分隔的、不規(guī)則、寬約3-18um、分枝較少且呈直角的菌絲在HE染色清晰,PAS和GMS染色不良發(fā)現(xiàn)菌絲是診斷的基礎(chǔ),真菌培養(yǎng),毛霉目中的致病菌在許多真菌培養(yǎng)基上快速生長對放線菌酮敏感，故培養(yǎng)基內(nèi)不用此藥，可加抗生素抑制細菌生長?；铙w標本不要研磨以免損壞菌絲，而妨礙生長。置于25℃～30℃培養(yǎng)，根據(jù)鏡下特征鑒定菌種。用于毛霉鑒定的培養(yǎng)基主要是PDA和SMA（毛霉合成培

33、養(yǎng)基）,毛霉的結(jié)構(gòu)特征,治療原則,積極控制基礎(chǔ)病及早起初壞死組織及時應(yīng)用兩性霉素B或泊沙康唑還可選擇伊曲康唑、特比萘芬,雙相型真菌,Dimorphic fungi,雙相型真菌,37 °C –酵母相,27 °C –菌絲相,定義,專指那些在組織內(nèi)或37℃培養(yǎng)時呈酵母相，于室溫中培養(yǎng)時則呈菌絲相的致病真菌包括申克孢子絲菌、馬內(nèi)菲青霉、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌和皮炎芽生菌等有較嚴格的地域分布（僅申

34、克孢子絲菌此點不突出）對人體致病力較強（有較大的侵襲性），患者不一定在感染前有免疫受損,馬內(nèi)菲青霉（Penicilium marneffei）,屬于雙相型真菌可引起馬內(nèi)菲青霉?。╬enicilliosis marneffei）主要流行區(qū)為東南亞，如泰國北部、越南、香港、臺灣及中國的南方目前已成為HIV陽性患者的主要條件致病菌,菌落特征,在SDA上，25℃培養(yǎng)，生長快，初為白色膜樣或絨狀，逐漸變?yōu)辄S色至黃綠色絨狀，2周后呈灰綠色

35、粉狀，能產(chǎn)生可溶性酒紅色色素，培養(yǎng)基呈紅色在BHI上，37℃培養(yǎng)，呈腦回樣皺褶的灰白色膜樣酵母菌落，無色素產(chǎn)生,菌落特征,菌絲相,酵母相,顯微鏡特征--菌絲相,帚狀枝分散，雙輪生，少數(shù)為單輪生，對稱或不對稱，有2～7個?；?，?；嫌?～6個瓶梗，頂端變窄，也可見單個瓶梗分生孢子呈橢圓形、球形，長而散亂，不成束,顯微鏡特征—酵母相,可見關(guān)節(jié)孢子，圓形、橢圓形及兩端鈍圓有橫隔的長形酵母細胞,莢膜組織胞漿菌（Histoplasma ca

36、psulatum）,屬于雙相型真菌有兩個變種，即莢膜組織胞漿菌莢膜變種（H.capsulatum var. capsulatum）和莢膜組織胞漿菌杜波變種（H. capsulatum var.duboisii）可引起組織胞漿菌病(histoplasmosis)在北美和拉丁美洲的一些特定區(qū)域流行,顯微鏡特征,真菌感染的非培養(yǎng)診斷,,非培養(yǎng)診斷檢測方法,G試驗檢測b-1,3 –D-葡聚糖ELISA法檢測曲霉抗原乳膠凝集試驗檢測新生

37、隱球菌抗原ELISA法檢測念珠菌抗原PCR_真菌通用引物、種屬特異性引物,方法：G試驗,β-葡聚糖可特異性激活鱟（Limulus）變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。- b-1,3-D-葡聚糖通過激活G因子（ Factor G）引起凝集；內(nèi)毒素通過激活C因子（Factor C）引起凝集；試劑盒: 祛除Factor C ?葡聚糖特異,β-1,3-D-葡聚糖 檢測范圍,不僅可檢測念珠菌感染曲霉、鐮刀菌 和很多

38、霉菌均存在β-1,3葡聚糖( Miyazaki, J Clin Micro 33:3115, ‘95)隱球菌細胞壁為alpha-葡聚糖,故為陰性陽性結(jié)果只能代表存在侵襲性真菌感染,不能確定種類假陽性: 紗布，某些血液透析的濾過器等,Clin Infect Dis 2004;39:199-205,侵襲性真菌感染中葡聚糖檢測,AML, MDSReceiving antifungal prophylaxis,,,Cut off6

39、0 pg/ml,Clin Infect Dis 2004;39:199-205.,30,30,with candidemia,control subjects,,侵襲性真菌感染的葡聚糖檢測Fungitell? assay,檢測曲霉半乳甘露聚糖抗原的 EIA 方法（Platelia）,檢測位于曲霉細胞壁上的 galactomannan,（GM）3. Detection – avidin-enzyme + substrate2.

40、Detecting Ab – anti-galactomannan [biotin conjugated]Ag – blood, urine, BAL1. Capture antibody –monoclonal anti - galactomannan,Specificity = >90% sensitivity = 75%,Platelia Aspergillus EIA – 結(jié)果判斷,曲霉的GM 抗原檢測

41、,乳膠凝集試驗（Pastorex®） (15ng/ml)酶連免疫吸附試驗（Platelia®） (1ng/ml),,Sabetta et al. JID 1985; 152: 946Ansorg et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 582Verweij et al. JCM 1995; 33: 3150Maertens et al. Bloo

42、d 2001; 97: 1604Herbrecht et al. J Clin Oncol 2002; 20: 1898,,GM 抗原,GM抗原檢測用于侵襲性曲霉病診斷,與臨床診斷和療效反應(yīng)有良好的一致性。檢測方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳膠凝集試驗等。Platelia試劑盒采用ELISA方法，敏感性~80%，特異性>80%。兒童假陽性10%。Cut-off值影響結(jié)果—0.5:早期診斷,特異性差;1.5:特異

43、性提高?？蓜討B(tài)觀察。Dr.Maschmeyer G. in 2nd Trends in Medical Mycology, 23-26 October 2005, Berlin,,曲霉感染檢測的影響因素,半乳甘露聚糖在血中存在時間短，建議： —高危人群每周至少檢測2次，動態(tài)觀察 —結(jié)合影象學(xué)、培養(yǎng)結(jié)果綜合分析診斷,假陰性,假陽性,哌拉西林/他唑巴坦與其它細菌或真菌成分有交叉反應(yīng) 腸道中定植的曲霉釋放GM進入血

44、液循環(huán) 含有谷物的食物中存在GM抗原，通過受損腸黏膜進入血循環(huán)導(dǎo)致抗原血癥，化療后出現(xiàn)嚴重黏膜炎的更易發(fā)生,檢測真菌DNA的PCR試驗,標本：全血血清活檢組織BALCSF,不同方法：? DNA 提取 ? PCR 設(shè)計? 產(chǎn)物檢測,,PCR,PCR技術(shù)用于診斷,,種特異-PCR非特異 PCR?雜交,Standart "single""nested"PCR-EIA"

45、;Real-time",標本全血血漿血清BAL,最低檢測范圍4-10 cfu/ml25-100 fg DNA,原位雜交,目的基因多拷貝基因,PCR過篩試驗診斷IA,每周監(jiān)測2次—通用引物;確定采用巢式和實時定量;敏感性100%,特異性65%;早于臨床癥狀2天,早于確診9天;動態(tài)觀察持續(xù)陰性可排除;,Dr.Maschmeyer G. in 2nd Trends in Medical Mycology, 23

46、-26 October 2005, Berlin, Germany.,,Jun Zhao et al. JCM 2001,Nested PCR in Animal Models,余進，等。中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003,種特異引物巢式 PCR擴增煙曲霉rRNA基因,動物模型中巢式PCR方法檢測的靈敏度,靈敏度=77.8%,余進，等。中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003,突破方向—,對基因組序列和功能的了解，找出特異處改進目前方法，提高敏感性Rea

47、l-time PCR多重PCR芯片技術(shù)其它特異抗原,DNA 微陣列,芯片、探針: Candida spp.Aspergillus spp.臨床標本:10-20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis: 75.6%DNA microarray: 87.9% Zhu et al. AAA. San Francisco, 9-12th September 2004,真菌非培養(yǎng)診斷小結(jié)—

48、,在診斷侵襲性真菌感染有一定價值，尤其早期診斷和療效監(jiān)測理想的檢測方法很少隱球菌乳膠凝集曲霉ELISAGlucanPCR方法有待驗證多次取材重要結(jié)合臨床表現(xiàn)、真菌學(xué)等傳統(tǒng)方法和影象學(xué),122 patients – 323 samples – 33 proven cases,肺曲霉病診斷時間表,Kami M et al, Clin Infect Dis 2001;33:1504-12,,真菌病診斷,感染病學(xué)家,真菌學(xué)家,生產(chǎn)