藥典版二部色譜法講義

1、主要內(nèi)容,色譜法的基本概念 色譜法在中國藥典中的沿革 中國藥典2010年版色譜法內(nèi)容概況 展望,何為色譜法,色譜法是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異(吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等)，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相叫固定相，另一相流過此固定相叫作流動相。由于各組分受流動相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力的不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動速度，使得結(jié)構(gòu)上只有微小差異的各組分得到分離。再配合

2、相應(yīng)的光學(xué)、電學(xué)、電化學(xué)和或其他相關(guān)檢測手段，對各組分進(jìn)行定性和定量分析的方法。,,色譜法的基本概念,,色譜法的基本概念,分離原理吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法 排阻色譜法,分離方法紙色譜法薄層色譜法柱色譜法 高效液相色譜法氣相色譜法,,色譜法的基本概念,特點分辨效力分析效率靈敏度操作及應(yīng)用,局限性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu),色譜法在中國藥典中的沿革,V A 紙色譜法(1985)V B 薄層色譜法(1985)

3、V C 柱色譜法(1985) V D 高效液相色譜法(1985)V E 氣相色譜法(1985)V F 電泳法(1990)V G 毛細(xì)管電泳法(2000)V H 分子排阻色譜法(2000)V J 離子色譜法(2010),高效液相色譜法在中國藥典二部的應(yīng)用,中國藥典2010年版色譜法內(nèi)容概況,V A 紙色譜法V B 薄層色譜法V C 柱色譜法V D 高效液相色譜法V E 氣相色譜法V F 電泳法(1990)V G 毛

4、細(xì)管電泳法(2000)V H 分子排阻色譜法(2000)V J 離子色譜法(2010),V A 紙色譜法,系以紙為載體，紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相，用展開劑進(jìn)行展開的分配色譜。,鑒別 純度檢查 含量測定,V B 薄層色譜法,系將供試品溶液點樣于薄層板上，經(jīng)展開、檢視后所得的色譜圖，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用于藥品的鑒別或雜質(zhì)檢查的方法。,V B 薄層色譜法,儀器與材料薄層板(增 “高效薄層板的粒徑一般為5~

5、7µm”)點樣器展開容器顯色劑(“碘蒸氣中顯色”修改為“適宜試劑的蒸氣中熏蒸顯色”)顯色裝置檢視裝置,V B 薄層色譜法,操作方法薄層板制備 ( 110℃活化30分鐘)點樣 (點樣基線距底邊2.0cm，點樣直徑為2~4mm(高效薄層板為1~2mm) ，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜，一般為1.0~2.0cm (高效薄層板可不小于5mm) )展開(“待展開至規(guī)定距離(一般為10~15cm)”調(diào)整為“待展

6、開至適宜的展距(如：20cm的薄層板，展距一般為10~15cm；10cm的高效薄層板，展距一般為5cm左右)”顯色與檢視,V B 薄層色譜法,系統(tǒng)適用性試驗檢測靈敏度 ( 系指雜質(zhì)檢查時，供試品溶液中被測物能被檢出的最低量。)比移值(Rf) (除另有規(guī)定外，比移值(Rf)應(yīng)在0.2~0.8之間。 )分離效能 (鑒別時，在對照品與結(jié)構(gòu)相似藥物的對照品制成的混合溶液；雜質(zhì)檢查時，雜質(zhì)對照品用供試品自身稀釋對照溶液溶解、用待測組分的對

7、照品溶液溶解、供試品以適當(dāng)?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液。 應(yīng)顯示兩個清晰分離的斑點)”,V B 薄層色譜法,測定法鑒別 (同濃度對照品溶液、供試品溶液與對照品溶液等體積混合)雜質(zhì)檢查 (雜質(zhì)對照品法、供試品溶液的自身稀釋對照法、或兩者并用 。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點數(shù)和單一雜質(zhì)量，當(dāng)采用系列自身稀釋對照溶液時，也可規(guī)定估計的雜質(zhì)總量),煙酰胺P856,V B 薄層色譜法,1　　2　　 3　　 41、煙酰胺溶液　2、煙酸溶液　3、堿破壞溶

8、液　4、混合溶液,,V C 柱色譜法,吸附柱色譜 分配柱色譜,V D 高效液相色譜法,系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。,V D 高效液相色譜法,(1) 色譜柱反相 (非極性:C18、C8、CN、NH2)(組分的出峰順序：極性大的先出峰，極性小的后出峰。 )正相 (極性：

9、硅膠)主要用于分離溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物(極性：固定相>流動相)離子交換分子排阻對映異構(gòu)體,V D 高效液相色譜法,(1) 色譜柱除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10µm之間，粒徑更小(約2µm)的填充劑常用于填裝微徑柱(內(nèi)徑約2mm)。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生

10、爭議時，應(yīng)以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。,V D 高效液相色譜法,(2) 檢測器選擇性 紫外、熒光、電化學(xué)通用型 蒸發(fā)光散射、示差折光,V D 高效液相色譜法,(3) 流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)(采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng))，如經(jīng)使用不合適時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。其中，調(diào)整流動相組分比例時，以

11、組分比例較低者(小于或等于50%)相對于自身的改變量不超過±30%且相對于總量的改變量不超過±10%為限，如30% 相對改變量的數(shù)值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%為限 。,V D 高效液相色譜法,系統(tǒng)適用性試驗 理論板數(shù) 分離度 重復(fù)性 拖尾因子,V D 高效液相色譜法,測定法 內(nèi)標(biāo)法 外標(biāo)法 加校正因子的主成分自身對照法 不加校正因子的主成分自身對照法 面積歸一化法,司帕沙

12、星P221,消旋山莨菪堿P866,硫酸卡那霉素P967,氨基糖苷類抗生素,蒸發(fā)光散射檢測法,阿米卡星P388,柱前衍生化法,V E 氣相色譜法,系采用氣體為流動相(載氣)流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。,V E 氣相色譜法,載氣源進(jìn)樣部分色譜柱柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),V E 氣相色譜法,V E 氣相色譜法,

13、各品種項下規(guī)定的色譜條件，除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體牌號、粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并符合系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于30分鐘內(nèi)記錄完畢。,V E 氣相色譜法,測定法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法面積歸一化法標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法 (當(dāng)采用頂空進(jìn)樣時，由于供試品和對照品處于不完全相同的基質(zhì)中，故可采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法以

14、消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時，應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)果為準(zhǔn)。),對于生產(chǎn)過程中引入的有機溶劑，應(yīng)在后續(xù)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)予以有效去除。除正文已明確列有“殘留溶劑”檢查的品種必須依法進(jìn)行該項檢查外，其他未在“殘留溶劑”項下明確列出的有機溶劑與未在正文中列有此項檢查的品種，如生產(chǎn)過程中引入或產(chǎn)品中殘留有機溶劑，均應(yīng)按附錄“殘留溶劑測定法”檢查并應(yīng)符合相應(yīng)溶劑的限度規(guī)定。（凡例 十七）,V E 氣相色譜法,頭孢泊肟酯P1

15、98殘留溶劑,V F 電泳法,是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核苷酸等)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠)中，在電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜并計算其含量的方法。,V G 毛細(xì)管電泳法,是指以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)供試品中各組分的淌度(單位電場強度下的遷移速度)和(或)分配行為的差異而實現(xiàn)各組分分離

16、的一種分析方法。,鹽酸頭孢吡肟P671,V H 分子排阻色譜法,是根據(jù)待測組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。,頭孢拉定P195,V J 離子色譜法,系采用高壓輸液泵系統(tǒng)將規(guī)定的洗脫液泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離的色譜分析方法。注入的供試品由洗脫液帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后，經(jīng)過抑制器或衍生系統(tǒng)進(jìn)入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。,一、離子色譜的基本原理,42,生命至

17、上 技澤天下,43,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,44,生命至上 技澤天下,淋洗液在線發(fā)生器——不用化學(xué)試劑，只用水（RFIC）環(huán)保：不直接接觸化學(xué)試劑使用方便：只用水和鼠標(biāo)，省時省力 重現(xiàn)性好：消除試劑雜質(zhì)的干擾、配制溶液的誤差和操作誤差，結(jié)果更可靠。 增加IC的應(yīng)用效能，提高靈敏度和分離度，改善重現(xiàn)性，擴展應(yīng)用，優(yōu)良的不同時間和不同實驗室之間的可比性。普通等濃度泵即可作梯度淋洗，梯度淋洗和等濃度淋

18、洗同樣簡單方便，延長泵的使用壽命。,45,生命至上 技澤天下,檢測方式電導(dǎo) 檢測具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測器離子色譜最常用的檢測器􀂊安培法 在特定的條件下可對某些化合物直接進(jìn)行氧化還原反應(yīng)􀂊紫外－可見光度法􀂃紫外直接吸收或可見光光度法測定選擇性強􀂃可進(jìn)行柱后衍生熒光法􀂃HPLC􀂊質(zhì)譜,46,

19、生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,47,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,48,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,49,生命至上 技澤天下,樣品的前處理,0.22，0.45um濾膜——去除顆粒狀雜質(zhì)C18預(yù)處理小柱、On-Guard RP柱——去除有機分子石墨化碳黑柱——去除色素On-Guard P柱——去除土壤中腐殖酸、苯環(huán)類的化合物On-Guard H、Na柱——去除溶液中的

20、金屬離子On-Guard Ag柱——去除溶液中的Cl-離子，主要測定高氯（海水）物質(zhì)中的NO2-，NO3-等離子在線／離線除糖——氨基酸樣品分析時，除去糖對氨基酸檢測時的干擾,50,生命至上 技澤天下,離子色譜法應(yīng)用,51,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,52,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,53,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,54,生命至上 技澤天下,三、離子