動力學(xué)液相色譜法.pdf

1、隨著生命科學(xué)的發(fā)展，眾多復(fù)雜生物樣品的分析、分離與純化為現(xiàn)代分離科學(xué)提出了許多熱點(diǎn)研究課題。色譜分離技術(shù)仍然是生物工程下游技術(shù)中的核心步驟，如何盡可能獲得良好分離效果是分離科學(xué)工作者追求的的一個重要目標(biāo)之一。近年來出現(xiàn)了一類全新的色譜分離方法，其分離機(jī)理與傳統(tǒng)的基于熱力學(xué)理論的分離模式不同，溶質(zhì)在動力學(xué)因素，如流動相流速、填料顆粒的型狀、大小的影響下具有不同的色譜保留特性，利用動力學(xué)因素對溶質(zhì)進(jìn)行分離，我們將其稱之為動力學(xué)色譜法。已有的

2、工作多集中在理論研究，實(shí)際應(yīng)用多限于分離一些標(biāo)準(zhǔn)小分子和DNA分子片段，因此該方法有待進(jìn)一步發(fā)展和開拓其用途。本文以反相液相色譜(RPLC)為載體，研究了溶質(zhì)的動力學(xué)色譜規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了溶質(zhì)普遍遵循的動力學(xué)方程式，提出了兩個描述溶質(zhì)動力學(xué)色譜行為的動力學(xué)參數(shù)，并將其用于實(shí)際樣品分離。論文包括以下六個部分： 1．文獻(xiàn)綜述：簡單地討論了色譜動力學(xué)的發(fā)展、基礎(chǔ)理論和主要內(nèi)容，包括塔板理論、速率理論、非平衡理論和質(zhì)量平衡理論四部分。闡述了動

3、力學(xué)色譜和色譜動力學(xué)的主要區(qū)別。重點(diǎn)綜述了兩種動力學(xué)色譜，即流體動力色譜和障礙色譜的分離原理、模型、儀器、應(yīng)用和二者之間的異同點(diǎn)及聯(lián)系。共引用文獻(xiàn)75篇。 2．以細(xì)胞色素—c肽譜為研究對象，初步研究了反相液相色譜中動力學(xué)因素對其分離效果的影響。重點(diǎn)討論了流動相流速對分離度、峰容量和溶質(zhì)洗脫順序的影響。同時研究了溶質(zhì)分子量與溶質(zhì)相對保留值之間的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)相對保留值與流速之間存在雙對數(shù)的線性關(guān)系log(RRT)=a+b log(

4、v)以及溶質(zhì)分子量與方程式中二經(jīng)驗(yàn)常數(shù)a值和b值之間的關(guān)系，并將該雙對數(shù)的線性關(guān)系方程式與SDT里的兩組線性方程式進(jìn)行了比較。 3．探討了小分子、多肽和大分子蛋白質(zhì)在反相液相色譜中的動力學(xué)色譜行為。提出了溶質(zhì)普遍遵循的動力學(xué)色譜方程式，即log(RRT)=a+b log(v)。詳細(xì)地探討了該動力學(xué)色譜方程式中的兩參數(shù)a、b在分離中的的意義，即參數(shù)a的意義定義為在流動相流速為1.0ml/min時溶質(zhì)的相對保留值的對數(shù)值，b值用來描

5、述溶質(zhì)相對保留值隨流速變化的趨勢大小。由于a、b均是在動力學(xué)因素流速變化的條件下描述溶質(zhì)保留情況的，因此，a、b是兩個與熱力學(xué)無關(guān)的動力學(xué)色譜參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)的相對保留值與分量之間無特定關(guān)系，也不符合SC或HDC機(jī)理。a、b之間具有一定的線性關(guān)系，但其相關(guān)系數(shù)不是很好。 4．RPLC中溶質(zhì)相對保留值和流動相流速之間存在雙對數(shù)線性關(guān)系，本章以Lys中4種較難分離的組分為研究目標(biāo)，根據(jù)動力學(xué)色譜方程式中的兩參數(shù)a、b的意義，對該4

6、種組分的分離進(jìn)行了動力學(xué)流速條件的優(yōu)化。由動力學(xué)色譜參數(shù)a，b值推測了溶質(zhì)在不同流速時色譜圖中的分離情況，驗(yàn)證了動力學(xué)參數(shù)a，b值所代表意義的合理性，并預(yù)測了分離的最佳流速。 5．溶質(zhì)在RPLC中滿足動力學(xué)色譜方程式log(RRT)=a+6 log(v)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)小分子的動力學(xué)參數(shù)b值普遍地小于大分子蛋白質(zhì)的b值，因此流動相流速對小分子相對保留值的影響趨勢大于大分子蛋白，小分子在色譜柱中比大分子蛋白遷移速度的快。本章?lián)颂岢隽藘?/p>

7、種分離復(fù)雜樣品的動力學(xué)色譜策略，即：a：在流速增大到一定程度時，小分子組分會和大分子組分在進(jìn)行梯度洗脫時會快速分成兩大部分，簡化了分離程序。b：小分子洗脫濃度是一個范圍，而蛋白質(zhì)大分子洗脫濃度很窄，可以認(rèn)為是一個點(diǎn)，洗脫復(fù)雜樣品時，可以先進(jìn)行一個適宜濃度的等度洗脫小分子，然后進(jìn)行梯度洗脫大分子。采用上述兩種動力學(xué)色譜策略對蟾蜍卵子細(xì)胞組分進(jìn)行了快速分離純化，并對高豐度多肽組分進(jìn)行了去除，同時富集了低豐度蛋白組分。預(yù)計(jì)該動力學(xué)色譜策略將為