實驗土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

1、生物制藥學實驗,實驗1-5 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及誘變系列實驗,實驗需知,實驗分組：2個實驗室，每個實驗室分6組（名單上報），每次實驗結束留1組同學值日實驗成績：占期末總成績的20%，包括實驗出勤、實驗操作、實驗結果及實驗報告撰寫實驗結束：將實驗用品收拾整齊，由實驗老師確認實驗結束后方可離開實驗報告：實驗目的、實驗原理、實驗步驟（注意事項）、實驗結果、思考題,系列實驗內(nèi)容,實驗1 土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選 （1、2）實驗2 產(chǎn)

2、淀粉酶菌株的誘變劑量選擇 實驗3 紫外誘變劑突變菌株的初篩 實驗4 紫外誘變劑突變菌株的復篩 實驗5 高產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性及淀粉酶活力測定,背景知識,淀粉酶（amylase, Amy, AMS ）：能水解淀粉、糖原和有關多糖中的O-葡萄糖鍵的酶 藥物：助消化藥，治療功能性消化不良,背景知識,產(chǎn)淀粉酶微生物：細菌、真菌等菌種分離與篩選步驟： 采樣——培養(yǎng)——分離——篩選誘變育種步驟： 誘變——初篩—

3、—復篩——性能檢測,背景知識,實驗1 土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選（1）,實驗目的,掌握菌種分離與篩選的方法從土壤中篩選出能夠合成分泌淀粉酶的微生物,實驗原理,自然界微生物種類繁多，有些微生物能夠以淀粉作為碳源進行生長繁殖，這是因為它們能夠合成分泌淀粉酶。當能合成淀粉酶的微生物在含有淀粉的固體培養(yǎng)基中生長時，會將淀粉酶分泌到菌體周圍，使菌落周圍的淀粉水解成為小分子量的糊精、聚糖和單糖。這些水解產(chǎn)物不能與碘作用，從而在菌體周圍形成透明圈

4、。,實驗步驟,1. 篩選培養(yǎng)基的配制（已完成）可溶性淀粉2 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL。 2. 倒平板（每組6個，每個平板10mL左右）,實驗步驟,3. 土樣的采集各實驗室分別取三種不同環(huán)境的土樣并記錄當時取樣環(huán)境情況（1-2、3-4、5-6每兩小組在同一個地方進行取樣），通常取離地面5～15cm處的土壤。4. 稀釋分離取土樣1 g，加入9 mL無菌水，逐步稀釋至105、

5、106、107 （單數(shù)組）或106、107、108（雙數(shù)組） ，每個梯度涂2個平板。,,,,,,10ml,1g,,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,10-1,10-2,10-7,10-6,10-5,10-4,10-3,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,稀 釋,,1ml,分離,,,實驗步驟,5.各組做好標記，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h（倒置培養(yǎng)？？）6. 產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定（下次課）,6. 產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定,倒平

6、皿（注意培養(yǎng)基狀態(tài)、體積、表面平整）：3個用接種環(huán)挑取單菌落到無菌瓶皿上（點植法：用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面接觸幾點），同時用簽字筆按對應順序對各單菌落進行標號。在原培養(yǎng)皿表面噴灑稀碘液，記錄有水解圈的單菌落，與此對應找出合成淀粉酶的菌株1-2株。注意：未分離得到菌落的小組可與其他組合作，挑取其他組鑒定得到的菌落進行后續(xù)實驗（實驗報告中注明使用哪一組的菌落）。,7. 產(chǎn)淀粉酶菌株的增殖培養(yǎng),液體培養(yǎng)基分裝：10ml/瓶，每個菌株對應

7、1瓶（每組1-2瓶，參考鑒定結果）液體培養(yǎng)基接種：用接種環(huán)從固體培養(yǎng)基表面上沾取少許菌苔，將接種環(huán)在液體培養(yǎng)基內(nèi)振搖幾次即可。做好標記，放入搖床中振蕩培養(yǎng)24h。,8. 產(chǎn)淀粉酶菌株的純化——平板劃線法,灼燒接種環(huán)，冷卻后用接種環(huán)挑取少量菌苔左手持平皿，將皿蓋打開一條縫隙，右手將接種環(huán)伸入皿中，劃3-4條平行線灼燒接種環(huán)，60°旋轉平皿，劃線（注意：后一區(qū)要求與前一區(qū)首尾相連，但不得與其他區(qū)域搭在一起）灼燒接種環(huán)，將

8、劃線平板倒置，于30℃培養(yǎng)48h后觀察。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,實驗結果及分析,1. 取樣環(huán)境情況2. 記錄產(chǎn)淀粉酶菌株數(shù)量（比透明圈？？）及對菌落的初步鑒定結果3. 分析：從不同地點獲得的結果為什么會出現(xiàn)差異？可以初步得出什么樣的結論？（未分離出菌株的原因？）,細菌菌落特征,較濕潤、光滑、透明、易挑取菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致質地均勻、小而突起（或大而平坦）有臭味或酸敗味,酵母菌菌落特征（與細菌相似

9、),圓形或卵圓形較濕潤、較粘稠、光滑，易挑取菌落質地均勻正反面、邊緣和中心顏色一致比細菌菌落大而厚，較不透明，顏色多呈乳白色多帶酒香味,霉菌菌落特點,大而疏松，呈絨毛狀（曲霉）、絮狀（毛霉）、地毯狀（青霉）或蜘蛛網(wǎng)狀（根霉）有的無固定大小，延至整個培養(yǎng)基中產(chǎn)色素，使菌落顯色,放線菌菌落特征,干燥、不透明，小而緊密，呈放射狀菌落初期表面光滑或呈致密的絲絨狀，當產(chǎn)生孢子之后，其菌落表面呈粉狀、顆粒狀菌落和培養(yǎng)基連接緊密，難

10、以挑取，或者整個菌落被挑起而不致破碎菌落顏色多樣，菌落正反面顏色常不一致帶有泥腥味,思考題,1. 為什么要用淀粉作為碳源？2. 為什么同一個土樣要稀釋不同梯度進行涂平板？,實驗報告,本次實驗與上次實驗合寫一份實驗報告即可實驗報告在本周六實驗課時上交,注意,每次實驗課前5分鐘由各實驗室本次值日小組將實驗材料由準備室取出至各實驗室中實驗結束后請各組同學務必與實驗老師處簽到后方可離開，否則記為缺勤最后一組同學使用完超凈臺后，需將臺