西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)cmttc醫(yī)學(xué)繼續(xù)教育項目

1、西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞株CNE凋亡實驗研究,麻發(fā)強 黃勇攀貴陽醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院貴陽醫(yī)學(xué)院,西妥昔單抗(Cetuximab) 是一種特異性針對EGFR的單克隆抗體，與EGFR結(jié)合可阻斷其自身受體相關(guān)激酶的活化與磷酸化以及有絲分裂信號的下傳，抑制腫瘤細胞的增殖、生長和誘導(dǎo)凋亡。,前 言,2006年美國FDA批準C225作為二線方案治療失敗的晚期頭頸部鱗癌。但對鼻咽癌治療中的作用還需要進一步的探討。本實驗主要研究

2、西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞株凋亡的效果和可能的機制。,前 言,一、材料與方法,細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞株CNE購于中國科學(xué)院上海細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，37℃恒溫，5％CO2, 95％濕度環(huán)境中傳代培養(yǎng)。,試驗分組 細胞胞培養(yǎng)48h后隨機組；先加入工作濃度（10μg/ml）的西妥昔單抗0.5μl，48h后照射，放療12Gy照射劑量。再行43℃熱療30min，后3

3、7℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時和48小時。,實驗分組,Hochest 33258熒光染色法觀察細胞凋亡,將干凈無菌的蓋玻片置于30mm2培養(yǎng)皿，接種細胞過夜；當(dāng)50%～80%滿時，同前述處理；24h后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗兩遍；固定液固定后用Hochest33258(5mg/L)染色；雙蒸水沖洗，封片；熒光顯微鏡下觀察并隨機拍照。,流式細胞術(shù)檢測各組CNE的凋亡率,取對數(shù)生長期的CNE細胞，每25cm2的培養(yǎng)瓶接種2×106個細胞，每組設(shè)

4、3個平行樣本，分別經(jīng)規(guī)定的處理因素處理后，消化收集細胞，用 Binding 緩沖液 400µl重懸，調(diào)整細胞密度為 1×106/ml；加入5µl Annexin V-FITC，混勻，4℃避光孵育15min；加入10µlPI染液（20µg/ml），4℃避光孵育 5min 后上流式細胞儀檢測，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。,Western Blot分析Bax、Bcl-2

5、蛋白的表達,加含PMSF裂解液冰上裂解30min提取蛋白，4℃ 12000rpm離心5min，取上清，蛋白定量后調(diào)整至濃度相同，95℃變性5min，8%聚丙烯胺凝膠電泳2h，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h。一抗（分別為1：200稀釋的Bax、Bcl-2、β-actin抗體)4℃過夜，TBST洗膜3次（每次5min）。,Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表達,二抗(1：500稀釋羊抗鼠IgG-AP)室溫孵育

6、1h，TBST洗膜3次（每次5min），AP顯色，運用圖像分析儀對結(jié)果進行圖像分析，計算條帶的積分吸光度，以Actin水平作為等量蛋白上樣參照。Bax和Bcl-2蛋白的測定，每組重復(fù)四次，以均值代表測定結(jié)果。,統(tǒng)計學(xué)方法,實驗結(jié)果用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準差(mean± S.D)表示，兩組間比較采用配對資料t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析Student-Newman-Keuls檢驗。P

7、<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。,,二、結(jié) 果,結(jié) 果,1、熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變（×400）,A:對照組 B：單純放療組,b,C:放療+熱療組,D:放療+西妥昔單抗,E:放療+熱療+西妥昔單抗,2、AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果,聯(lián)合應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI對培養(yǎng)體系中的細胞進行染色，AnnexinV(-)/PI(-)代表健康活細胞，Ann

8、exinV(+)/PI(-)代表早期凋亡細胞，AnnexinV(+)/PI(+)代表晚期凋亡和壞死細胞。本實驗經(jīng)處理后，主要觀察AnnexinV(+)/PI(-)的早期凋亡細胞。,2、AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果,A：對照組 B：單純放療組 C：放療+熱療組,D：放療+西妥昔單抗組 E：放療+熱療+西妥昔單抗組,2、AnnexinV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果

9、,#表示與對照組比較，P＜0.05； ※表示與單放組、放+熱組、放+西組比較，P＜0.01；＊表示與24h比較，P＜0.05,表1：西妥昔單抗聯(lián)合放療與熱療誘導(dǎo)CNE細胞凋亡效果分析,3、 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表達,為了檢測不同處理因素作用CNE后24h的Bax、Bcl-2蛋白表達情況：與單放組、放療+熱療組比較，放療+西妥昔單抗和放+熱+西妥昔單抗聯(lián)合治療組Bax蛋白表達有差異（P＜0.05）；與單放、

10、放療+熱療放療+西妥昔單抗比較，放+熱+西妥昔單抗聯(lián)合治療組下調(diào)Bcl-2蛋白表達作用顯著（P＜0.05）（圖3）,3、 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表達,,?-action（42KD）,Bax (20KD),Bcl-2 （ 26KD）,3、Western Blot分析Bax蛋白的表達,#,*,#表示放療+西妥昔與單放組和放熱組比較，P＜0.05； *表示綜合治療組與單放組、放+熱組、放+西組比較，P＜0.0

11、5，,3、Western Blot分析Bcl-2蛋白的表達,*,*表示綜合治療組與單放組、放熱組、放+西組比較，P＜0.05，,,三、討 論,討 論,腫瘤的分子靶向治療是當(dāng)今腫瘤研究中的熱點，其中EGFR在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在高表達和異常激活[1]。西妥昔單抗作為一種人鼠嵌合型抗體。與EGFR結(jié)合可抑制由內(nèi)源性配體引起的EGFR活化，細胞周期中G1停止，細胞增殖減少，凋亡增加，血管生成減少，侵襲力、轉(zhuǎn)移能力降低。,討

12、 論,Curran D等報道單用西妥昔單抗與放療聯(lián)合都取得了理想的抗腫瘤效果[6]，F(xiàn)eng FY等報道證實單用西妥昔單抗與放療聯(lián)合對頭頸部腫瘤細胞有放療增敏作用[7]。,討 論,熱療是公認的“綠色治療”，幾乎無副作用，是臨床上重要的輔助治療方法之一。近年來，通過與化放療聯(lián)合，熱療作為一種輔助的抗腫瘤手段日益受到人們重視。,討 論,西妥昔單抗誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、擾亂腫瘤細胞增殖動力學(xué)，使細胞周期停滯在對放療相對敏感的G1期

13、，而使對放療抗拒的S期細胞減少，從而增加細胞的放療敏感性[9]。熱療誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[10]，可抑制放療引起的亞致死損傷及潛在致死損傷的修復(fù)[11]；熱放療協(xié)同。,討 論,本實驗序顯示：放療、放+熱、放+西妥昔單抗或放+熱+西妥昔單抗治療后可出現(xiàn)CNE細胞形態(tài)學(xué)改變，引起凋亡，尤其靶放熱三者聯(lián)合形態(tài)學(xué)改變最為顯著； 流式細胞凋亡檢測顯示：聯(lián)合治療組的凋亡率均顯著高于單放、放+熱、靶放組，表明三者在誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡的過程中有較好

14、的協(xié)同作用。,討 論,在細胞凋亡調(diào)控過程中，采用分子生物學(xué)手段檢測了促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達。結(jié)果顯示：各干預(yù)組Bcl-2蛋白表達均有不同程度的下降，這就說明放療、放療+熱療、靶療+放療及靶+放+熱療治療能夠抑制，但以靶+放+熱降低最為明顯。,討 論,Bax促凋亡蛋白，在各干預(yù)組中，靶療+放療及靶+放+熱中表達最為明顯，這說明靶療+放療+熱有協(xié)同促進了腫瘤細胞的凋亡。,結(jié) 論,西妥昔單抗聯(lián)合放療及熱療