西妥昔單抗聯(lián)合順鉑體內(nèi)外抑瘤作用及其分子機(jī)制.pdf

1、隨著分子腫瘤學(xué)的發(fā)展，人們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)日益深入，關(guān)于腫瘤分子靶點(diǎn)治療的研究與應(yīng)用是當(dāng)前腫瘤治療中一個(gè)發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域?；熓悄[瘤治療的三大手段之一，但腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。另外，化療的作用機(jī)理是依耐腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在生長、修復(fù)、死亡的動(dòng)力學(xué)差異，因此此類藥物不可避免地會(huì)影響正常細(xì)胞，而帶來臨床上多種不良反應(yīng)而限制其應(yīng)用。分子靶點(diǎn)治療是治療介質(zhì)在特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞或腫瘤基質(zhì)靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上抑制、

2、殺傷靶點(diǎn)細(xì)胞，如非結(jié)合型單克隆抗體、小分子靶點(diǎn)藥物和基因治療等。分子靶點(diǎn)治療藥物因其具有高選擇性和低毒性，已成為腫瘤治療的又一有力手段。 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物體各種生物學(xué)行為的基礎(chǔ)，信號(hào)通路的異常與腫瘤的關(guān)系十分密切。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor)屬于酪氨酸激酶受體超家族e(cuò)rbB成員之一。許多腫瘤中表皮生長因子表達(dá)增強(qiáng)，包括結(jié)腸、頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌、胰腺癌、非小細(xì)胞

3、肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌等。EGFR的表達(dá)或功能的改變?cè)鰪?qiáng)配體產(chǎn)生，增加受體基因轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增，或受體突變導(dǎo)致其酪氨酸激酶持續(xù)激活，從而致使其下游信號(hào)通路的增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖和抵抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)生存，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。因此，近年來以EGFR為靶點(diǎn)的藥物的開發(fā)和應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，并在臨床應(yīng)用中取得巨大的突破。 順鉑是一個(gè)應(yīng)用于臨床有三十多年歷史的經(jīng)典化療藥物，被廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤的治療，

4、如卵巢癌，大腸癌，非小細(xì)胞肺癌等。但其常易引發(fā)耐藥而致預(yù)后較差，同時(shí)順鉑的毒性反應(yīng)所導(dǎo)致的低耐受性也限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找低毒安全的化療增敏藥物聯(lián)用是提高順鉑臨床應(yīng)用效果的一個(gè)重要方向。西妥昔單抗(Cetuximab，IMC-C225)是第一個(gè)在全球多個(gè)國家獲準(zhǔn)上市的特異性靶向EGFR胞外區(qū)的人鼠嵌合型單克隆抗體，已在多種腫瘤的體外和臨床實(shí)驗(yàn)中取得了良好的抑瘤效果，在大腸癌、頭頸腫瘤、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的治療中其與化療藥物聯(lián)用顯著

5、地提高的化療療效，而且不良反應(yīng)輕，不增加化療藥物的毒副反應(yīng)，耐受性較好。目前已被美國FDA批準(zhǔn)用于晚期的結(jié)直腸癌和化療失敗的復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性頭頸腫瘤以及其它惡性腫瘤的輔助治療。但是西妥昔單抗在臨床中的應(yīng)用仍存在盲目性和無選擇性，目前也仍然缺乏確實(shí)有效的可預(yù)測療效的分子標(biāo)志物來指導(dǎo)其應(yīng)用。本課題通過研究昔妥西單抗對(duì)于鼻咽癌及肺癌細(xì)胞株體外和體內(nèi)的順鉑敏感性的影響來探討其是否具有增敏順鉑療效、是否可以逆轉(zhuǎn)對(duì)順鉑的耐藥，以及可能的機(jī)制，為西妥昔

6、單抗在臨床中的選擇性應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。 一、西妥昔單抗與順鉑聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 1.西妥昔單抗單藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響我們首先觀察了西妥昔單抗單藥對(duì)四株鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、SUNE1和HONE1及一對(duì)肺癌細(xì)胞A549和A549／DDP生長的影響，分別以2.5、5、10、20、40、80、160 μ/ml的西妥昔單抗處理細(xì)胞72h后，MTT法檢測其抑制效果，在四株鼻咽癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中其抑制率一直低于

7、20％，表明西妥昔單抗單藥對(duì)鼻咽癌和肺癌細(xì)胞的生長無明顯的抑制作用，且無劑量依耐性。 2.西妥昔單抗聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響以低于細(xì)胞毒作用濃度的順鉑(0.16 μg／ml)與濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、160 μg/ml的西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用，能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并呈劑量依賴性，但在西妥昔單抗?jié)舛冗_(dá)20-40 μg／ml時(shí)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制作用達(dá)到平臺(tái)。在肺癌A549細(xì)胞中我們也觀察到了同樣的作用趨

8、勢，但是不同濃度的藥物處理對(duì)A549／DDP細(xì)胞的增殖影響不明顯。 二、西妥昔單抗對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的影響用100μg/ml的西妥昔單抗處理細(xì)胞24h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示處理組和對(duì)照組細(xì)胞周期分布無明顯差別，表明西妥昔單抗單藥對(duì)鼻咽癌和肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布無明顯影響。但西妥昔單抗與順鉑聯(lián)用可增加順鉑對(duì)細(xì)胞周期分布的作用，即增加sub-G1期和G1期的細(xì)胞，減少S期細(xì)胞的分布。 三、西妥昔單抗對(duì)EGF活化

9、的EGFR信號(hào)通路的影響EGFR信號(hào)通路有三條主要下游信號(hào)通路，即ras-raf-MAPKs信號(hào)通路；PI3K-AKT信號(hào)通路；JAK-STAT3信號(hào)通路。ERK、AKT和STAT3分別是這三條信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，我們通過檢測p-ERK、p-AKT和p-STAT3的組成性表達(dá)水平來判斷這三條通路的活化水平。先用濃度為0.1、1、10、100 μg／ml的西妥昔單抗將細(xì)胞處理24小時(shí)后，再用10ng EGF刺激15分鐘，經(jīng)Western

10、 blot檢測顯示，EGF可顯著地活化EGFR下游的三條信號(hào)通路，但是此活化作用可被西妥昔單抗所抑制，即p-ERK、p-AKT和p-STAT3的表達(dá)水平可被西妥昔單抗作用而較對(duì)照組減少，且此抑制作用是呈濃度依耐性的增加的，但它們的總蛋白表達(dá)水平始終無變化。這表明西妥昔單抗是可以發(fā)揮其與EGFR的配體競爭性結(jié)合EGF從而抑制下游信號(hào)通路的活化的。我們?cè)陧樸K敏感細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株中均觀察到了類似的效應(yīng)。 四、西妥昔單抗對(duì)DDP活化的

11、EGFR信號(hào)通路的影響為了研究兩藥聯(lián)合作用的機(jī)制，我們用濃度分別為5、10、20μM的順鉑處理細(xì)胞，觀察其對(duì)EGFR信號(hào)通路活化的影響。Western Blot結(jié)果顯示，在順鉑敏感的細(xì)胞株，順鉑可濃度依耐性地上調(diào)EGFR信號(hào)通路的活化，使得p-ERK和p-AKT的表達(dá)上調(diào)。同樣，我們先用濃度為0.1、1、10、100μg／ml的西妥昔單抗將細(xì)胞處理24小時(shí)后，再用10 μM DDP刺激后，Western blot檢測p-ERK和p-AK

12、T的表達(dá)水平顯示，DDP對(duì)EGFR信號(hào)通路的活化作用可被西妥昔單抗所抑制，即DDP誘導(dǎo)的p-ERK、p-AKT的上調(diào)表達(dá)可被西妥昔單抗抑制，此作用是呈濃度依耐性的增加的，而它們的總蛋白表達(dá)水平始終無變化。在順鉑耐藥細(xì)胞株中，順鉑并不能明顯刺激活化EGFR下游信號(hào)通路，即對(duì)p-ERK和p-AKT的表達(dá)水平無調(diào)節(jié)作用，且西妥昔單抗對(duì)此也無明顯影響。 五、西妥昔單抗對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的作用為了觀察西妥昔單抗在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響

13、，我們分別建立了HONE1細(xì)胞和A549細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)抑制瘤模型，分為四組，分別給予不同處理：生理鹽水對(duì)照組、西妥昔單抗單藥組、順鉑單藥組和兩藥聯(lián)用組。HONE1細(xì)胞和A549細(xì)胞裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示：昔妥西單抗單藥組的腫瘤體積變化與生理鹽水對(duì)照組相比無顯著性差異；而順鉑單藥組和兩藥聯(lián)用組腫瘤體積均明顯小于對(duì)照組;兩藥聯(lián)用組的腫瘤體積增長較順鉑單藥組慢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各處理組治療前后未見藥物毒副反應(yīng)． 免疫組化結(jié)果顯示在HONE

14、1細(xì)胞裸鼠移植瘤標(biāo)本中p-AKT及p-ERK在順鉑單藥處理組中較生理鹽水對(duì)照組明顯上調(diào)，而昔妥西單抗組和兩藥聯(lián)用組則無明顯變化；在A549裸鼠移植瘤標(biāo)本中p-ERK在順鉑單藥處理組中較生理鹽水對(duì)照組明顯上調(diào)，而昔妥西單抗組和兩藥聯(lián)用組則無明顯變化，p-AKT在各處理組均為高表達(dá)。ERCC1在順鉑單藥處理組中較其他組表達(dá)略高。 六、西妥昔單抗對(duì)肺癌細(xì)胞切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)表達(dá)的影響 七、下調(diào)ERCC1的表達(dá)

15、對(duì)肺癌細(xì)胞的藥物敏感性的影響ERCC1的表達(dá)和調(diào)控在A549和A549／DDP細(xì)胞中存在差異。我們通過SiRNA干擾的手段來抑制ERCC1的表達(dá)，探討去除了ERCC1調(diào)控的影響對(duì)于細(xì)胞的順鉑敏感性的有無改變。在分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ERCC1的SiRNA48h后，再分別用西妥昔單抗單藥、順鉑單藥及兩藥聯(lián)用處理細(xì)胞，經(jīng)MTT檢測藥物的抑制作用。結(jié)果顯示：在A549/DDP細(xì)胞，ERCC1的表達(dá)被干擾后，兩藥聯(lián)用的效果較在陰性對(duì)照組顯著增強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)染

16、陰性對(duì)照SiRNA的A549／DDP細(xì)胞，西妥昔單抗和順鉑聯(lián)用較順鉑單藥處理對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用無明顯差別；扣除ERCC1干擾本身對(duì)順鉑敏感性的增強(qiáng)后，兩藥聯(lián)用組的抑制效果仍較順鉑單藥組好。在A549細(xì)胞，ERCC1的表達(dá)被干擾后，兩藥聯(lián)用的效果較在陰性對(duì)照組無顯著差異，且ERCC1干擾本身對(duì)A549細(xì)胞的順鉑敏感性無明顯影響。 結(jié)論 1.西妥昔單抗單藥對(duì)鼻咽癌和肺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期均無明顯影響，但可顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)敏

17、感株細(xì)胞的增殖的抑制作用，而對(duì)肺癌耐藥株細(xì)胞的藥物敏感性無明顯影響。 2.順鉑可誘導(dǎo)鼻咽癌和肺癌順鉑敏感細(xì)胞株中EGFR信號(hào)通路的活化并上調(diào)ERCC1的表達(dá)，此活化作用可被西妥昔單抗所抑制；而耐藥株細(xì)胞EGFR信號(hào)通路的活化和ERCCl的表達(dá)不受順鉑和西妥昔單抗的作用的影響。 3.用RNA干擾的方法下調(diào)ERCC1的表達(dá)后，西妥昔單抗可提高肺癌耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性。 4.西妥昔單抗可提高順鉑敏感細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏