多克隆抗體的制備

1、實(shí)驗(yàn)一 多克隆抗體制備,微生物與免疫教研室周芳美,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握多抗制備的原理和過(guò)程熟悉常用的佐劑掌握福氏完全佐劑的作用機(jī)理和制備方法掌握研磨法和注射器法制備免疫乳劑，掌握制備成功的判別標(biāo)準(zhǔn)掌握動(dòng)物的免疫方法,二、實(shí)驗(yàn)原理,抗體：介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原激活后增殖分化為漿細(xì)胞所合成分泌的一類(lèi)能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體：抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決

2、定簇激活具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)這一抗原決定簇的抗體，稱(chēng)為···,天然抗原分子中常含有多種不同抗原特異性的抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活，產(chǎn)生的抗體中含有針對(duì)多種不同抗原表位的免疫球蛋白，稱(chēng)為多克隆抗體。,多克隆抗體,多克隆抗體制備的意義,免疫血清：將抗原注入機(jī)體所產(chǎn)生的抗體是針對(duì)多種抗原決定簇的混合抗體，含有這種特異性抗體的血清。免疫血清作用：對(duì)傳染病的診斷、

3、預(yù)防和治療有重要意義，而且對(duì)器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。,多克隆抗體優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn) ：作用全面，具有中和抗原，免疫調(diào)理，介導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，ADCC等作用，來(lái)源廣泛，制備容易。 缺點(diǎn)：特異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而應(yīng)用受限。,三、實(shí)驗(yàn)試劑與材料,動(dòng)物：健康家兔抗原：生化大實(shí)驗(yàn)中制備的LDL佐劑：弗氏佐劑注射器、研缽 等,動(dòng)物的選擇,動(dòng)物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來(lái)決定，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)如要獲

4、得大劑量的抗體，則采用大動(dòng)物；如要獲得直接標(biāo)記診斷用的抗體，則直接采用本動(dòng)物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動(dòng)物制備抗體,動(dòng)物的選擇,如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備免疫用的動(dòng)物最好選擇適齡的健康雄性動(dòng)物，免疫時(shí)應(yīng)同時(shí)選用數(shù)只動(dòng)物進(jìn)行免疫一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔子和羊；,抗原,就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類(lèi)脂抗原、多糖類(lèi)抗原和核酸抗原等.根據(jù)物理性狀可分為顆粒型抗原和可溶性抗原。

5、就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原,不同的抗原，其免疫原性的強(qiáng)弱均不相同，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)、物理形狀和彌散速度等本次實(shí)驗(yàn)采用抗原是生科大實(shí)驗(yàn)制備的LDL（至少有2mg，如量不夠則用牛血清白蛋白），用生理鹽水溶解。,抗原劑量的選擇,抗原的免疫劑量依照給予抗原的種類(lèi)，免疫次數(shù)，注射途徑，以及受體動(dòng)物的種類(lèi)，免疫周期及所要求的抗體特性等而不同。劑

6、量過(guò)低，不能形成足夠強(qiáng)的免疫刺激劑量過(guò)高，有可能造成耐受在一定范圍內(nèi)，抗體效價(jià)隨注射抗原的劑量而增高。,抗原劑量的選擇,小鼠首次抗原劑量為：50-400μg/次大鼠為100-1000μg/次兔子為200-1000μg/次加強(qiáng)免疫的劑量為首次劑量的1/5-2/5,佐劑,概念：預(yù)先與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的非特異性免疫增強(qiáng)性物質(zhì)。種類(lèi)：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分

7、枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無(wú)免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。目前應(yīng)用最多的是弗氏佐劑。,佐劑,佐劑的條件作為一種良好的佐劑，必須具備下列條件： （1）增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性； （2）佐劑與抗原混合能延長(zhǎng)抗原在局部組織的存留時(shí)間，減低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體； （3）佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞

8、并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫功能； （4）良好的佐劑應(yīng)具有無(wú)毒性或副作用低的特點(diǎn)。,佐劑,主要作用機(jī)制：①改變抗原物理性狀，延緩抗原的降解和排除，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)滯留的時(shí)間②刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其對(duì)抗原的處理和提呈能力③刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的能力,佐劑,主要用途：①增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答，用于預(yù)防接種及制備動(dòng)物免疫血清②作為非特異性免疫增強(qiáng)劑，用于抗腫瘤與抗感染的輔助治

9、療,弗氏佐劑,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最常用的佐劑：①弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant IFA) 羊毛脂 1 份 +石蠟油 5 份，混合，高壓滅菌后保存。用時(shí)加熱融化，冷卻至50℃左右，加抗原進(jìn)行乳化處理。 ②弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA) 弗氏不完全佐劑 10ml +卡介苗 10mg～200mg 卡介苗可1

10、00℃10min滅活處理。,四、步驟和方法,顆粒性抗原多克隆抗體的制備——傷害桿菌O抗血清的制備（介紹）1、傷害桿菌O抗原的制備：,,接種,37℃ 18-24h,洗下菌苔（用NS）,,100℃ 1h,過(guò)濾,,4000r/min,20min,得到原液,,稀釋,109/ml應(yīng)用液,顆粒性抗原多克隆抗體的制備——傷害桿菌O抗血清的制備（介紹）,2、免疫方法： 選擇體重2-3kg的健康家兔，將已經(jīng)稀釋好的抗原按下列劑量及程序做皮內(nèi)注

11、射。第一天注射1ml，第8天注射1ml，第15天注射2ml，末次注射后7天頸動(dòng)脈放血，測(cè)效價(jià)。,可溶性抗原多克隆抗體的制備,第一次免疫（基礎(chǔ)免疫）,第一次加強(qiáng)免疫,第二次加強(qiáng)免疫,效價(jià)測(cè)定,2-4周,2-3周,,,,7天,第一次免疫（基礎(chǔ)免疫）,免疫乳劑的制備①研磨法: 取1.2ml佐劑加入到無(wú)菌的研缽中，緩慢加入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，每加一滴研磨至小滴消失，邊加邊往同一個(gè)方向研磨，抗原全部加入后繼續(xù)研磨至乳白色

12、粘稠的油包水乳劑。,①研磨法,本法適于制備大量的佐劑抗原，缺點(diǎn)是研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大。注意事項(xiàng)：⑴每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失，滴加速度要慢⑵邊加邊往同一方向研磨，否則不易制成乳白色粘稠的油包水乳劑，免疫效果就差。,免疫乳劑的制備,②注射器法： 取1.2ml佐劑+1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，用兩個(gè)注射器用皮管對(duì)接，使佐劑和抗原往返推拉，直至乳化完全。 適用于制備少量的抗原乳劑。本法優(yōu)點(diǎn)是容易做到無(wú)

13、菌操作，抗原損失少。,免疫乳劑制備成功的判別標(biāo)準(zhǔn),油包水狀態(tài) 鑒定方法是將乳化劑滴入4℃左右冷水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。,免疫,將制成的乳劑吸入注射器，在兔子背部及頸部皮下注射8-10點(diǎn)，每點(diǎn)約0.2ml每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫,每點(diǎn)0.2ml,共加強(qiáng)2次。第二次加強(qiáng)免疫開(kāi)始,在免疫后第7天用免疫雙擴(kuò)散法檢查抗體效價(jià)。,思考題,佐劑的

14、種類(lèi)有哪些？佐劑的作用原理是什么？有何用途弗氏佐劑中弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑有何區(qū)別？抗原的免疫原性與哪些因素有關(guān)？,第一次加強(qiáng)免疫,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握多克隆抗體的應(yīng)答特點(diǎn) 2.理解加強(qiáng)免疫的作用和必要性 3.加強(qiáng)動(dòng)物技能,實(shí)驗(yàn)原理,體液免疫的一般規(guī)律 在抗原誘導(dǎo)下，漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體經(jīng)淋巴液和血液流向全身，血液中抗體的濃度隨應(yīng)答時(shí)間的持續(xù)而增高。在初次接受抗原刺激中，機(jī)體發(fā)生初次應(yīng)答，再次接受相同抗原刺激，機(jī)體產(chǎn)

15、生二次應(yīng)答或稱(chēng)回憶應(yīng)答。,初次應(yīng)答和再次應(yīng)答的特點(diǎn)和比較,加強(qiáng)免疫的作用和必要性,再次應(yīng)答，增加抗體量增強(qiáng)抗體的親和力,材料和試劑,試劑：LDL抗原溶液，佐劑材料：注射器，研缽，消毒棉球,實(shí)驗(yàn)步驟,免疫乳劑的制備（注射器法和研缽法任選） 取抗原溶液（基礎(chǔ)免疫的2/5）+弗氏不完全佐劑制備成油包水狀態(tài).免疫 將制成的乳劑吸入注射器，在兔子背部及頸部皮下注射，每點(diǎn)約0.2ml.,第二次加強(qiáng)免疫,實(shí)驗(yàn)原理及方法同第一次加強(qiáng)