犬松弛素原多克隆抗體的制備.pdf

1、松弛素(Relaxin，RLX)是由AB二鏈構(gòu)成的短肽鏈激素，歸屬于胰島素家族。松弛素具有廣泛的生理功能，包括生殖調(diào)控、舒張血管調(diào)節(jié)血循環(huán)、抗炎及促進炎性反應(yīng)愈合等。目前對松弛素基因的研究主要集中在人、小鼠、豬等物種上，國外已克隆了犬前松弛素原(preprorelaxin)的基因序列，鑒于此，本研究以犬胎盤、卵巢組織為材料，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得多條犬前松弛素原基因cDNA，進行克隆并作生物信息學分析，同時構(gòu)建犬松弛素原(prorel

2、axin)原核表達載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，使其表達相應(yīng)蛋白質(zhì)。再將表達的重組蛋白免疫新西蘭兔以制備多克隆抗體。上述方法大程度的推動了松弛素的結(jié)構(gòu)和功能的研究。本研究具體如下:
　　1、犬前松弛素原基因的克隆和生物信息學分析
　　本研究以北京犬和吉娃娃新生胎盤、貴賓犬卵巢為材料，采用RT-PCR技術(shù)擴增前松弛素原基因，結(jié)果顯示:本實驗完整克隆了從所獲樣品中擴增到的預(yù)期大小目的片段，包含一個534 bp的開放閱讀框，編碼177個

3、氨基酸。將所擴增片段進行序列分析顯示，與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫檢索的犬preprorelaxin的cDNA序列同源性為99.6％，均有3個核苷酸位點發(fā)生改變，從而引起相應(yīng)氨基酸改變，但并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化。進化樹分析結(jié)果顯示，所獲三條目的片段同為一支，與貓preprorelaxin基因的進化距離最近。生物信息分析顯示，3條序列等電點、帶電荷數(shù)、最高最低氨基酸、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)一致，分子式分子量、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均疏水

4、指數(shù)有細微差異;跨膜區(qū)、信號肽、糖基化位點分析結(jié)果一致;二級結(jié)構(gòu)組成一致，包含α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲，比例存在細微差異。
　　2、犬松弛素原的原核表達及多克隆抗體制備
　　以從北京犬胎盤組織克隆的犬前松弛素原cDNA片段為模板，用特異引物克隆獲得松弛素原基因，長度為459 bp，后與帶有多聚組氨酸(6×His)的原核表達載體pET28a相連，成功轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR、酶切以及測序鑒定為陽性后，提取pET2

5、8a-prorelaxin重組質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化到表達菌BL21(DE3)中表達;利用SDS-PAGE電泳和免疫印跡實驗分析菌體裂解液和培養(yǎng)上清液，結(jié)果顯示目的蛋白以包涵體形式表達，目的蛋白分子量為22kD結(jié)果與生物信息學預(yù)測結(jié)果一致。以誘導表達菌體裂解液純化蛋白為免疫原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和免疫印跡(Western blotting)對免疫家兔血清進行分析，結(jié)果顯示血清中犬松弛素原抗體效價達