car-t基礎(chǔ)知識(shí) ppt課件

1、CAR-T基礎(chǔ)知識(shí),向莉偉 CAR-T細(xì)胞部2017.07.27,導(dǎo)言：CAR-T（嵌合抗原受體T細(xì)胞）藥物是一種有生命的藥物，原理在于經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞，可以特異性地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，使效應(yīng)T細(xì)胞的靶向性、殺傷活性和持久性均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細(xì)胞高，從而發(fā)揮抗癌作用。CAR-T細(xì)胞療法在早期的臨床試驗(yàn)中并沒有表現(xiàn)出驚人的療效，然而隨著抗CD19 CAR-T細(xì)胞療法在B細(xì)胞惡性腫瘤中顯示出的巨大潛力，CAR-T產(chǎn)品一時(shí)

2、間成了抗腫瘤領(lǐng)域的新星。,什么是CAR-T細(xì)胞,嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）T細(xì)胞技術(shù)；是過繼細(xì)胞免疫治療（adoptive cellular immunotherapy，ACI)的一種；通過基因改造技術(shù)，讓患者T細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體，使效應(yīng)T細(xì)胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細(xì)胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)；是一種特異性的免疫細(xì)胞抗腫瘤治療

3、。,T淋巴細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的天敵，在腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞有極強(qiáng)的殺傷作用。對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因工程處理，從而在其表面表達(dá)能夠識(shí)別特異性腫瘤抗原的特殊受體稱為嵌合抗原受體（CAR），同時(shí)在受體的胞內(nèi)段可加上引起T細(xì)胞活化的信號(hào)傳遞區(qū)域。腫瘤對(duì)患者的免疫系統(tǒng)具有抑制作用，限制了自身免疫功能的誘導(dǎo)和激活，因此可以把患者的免疫細(xì)胞放到一種可以避開腫瘤抑制因素的環(huán)境中進(jìn)行激活和擴(kuò)增，然后再將擴(kuò)增后的免疫細(xì)胞回輸患者，從而使患者的

4、免疫功能迅速增強(qiáng)，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，這種療法就是過繼性免疫療法,CAR-T技術(shù)原理：嵌合抗原受體（CARs）是由一個(gè)胞外抗原識(shí)別域（通常是一個(gè)單鏈抗體，也可以是多肽或者其他蛋白質(zhì)）和一個(gè)胞內(nèi)信號(hào)域組成。CAR的胞外部分用來識(shí)別特異性的腫瘤抗原，隨后胞內(nèi)信號(hào)域會(huì)刺激T細(xì)胞增殖，并且通過細(xì)胞溶解和細(xì)胞因子釋放來消除腫瘤細(xì)胞。,第一代CARs的胞內(nèi)信號(hào)域是CD3ζ信號(hào)鏈（signal 1），這一代產(chǎn)品在臨床試驗(yàn)中效果有限，可能由于移

5、植T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（AICD）或者T細(xì)胞擴(kuò)增的持續(xù)性不好所導(dǎo)致。第二代CARs相比第一代CARs增加了一個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)域（signal 2）。在過去的5年里，對(duì)于第二代含有CD28或者4-1BB(CD137) 共刺激信號(hào)域的抗CD19 CAR-T，在治療B淋巴細(xì)胞白血病的臨床試驗(yàn)中都表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，但是仍然需要尋找更好的共刺激信號(hào)分子，來解決第二代CAR-T產(chǎn)品作用不持久等問題。第三代CARs不僅包含CD3ζ信號(hào)域，還包

6、括兩個(gè)共刺激信號(hào)分子（圖1），這些共刺激信號(hào)分子主要包括CD28、4 -1BB以及OX40 (CD134)等，在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)第三代CAR-T細(xì)胞療法效果要優(yōu)于第二代產(chǎn)品,CAR構(gòu)成（1）----scFV（單鏈抗體）,識(shí)別腫瘤表面抗原,特異性,CAR構(gòu)成（2）----TCR/CD3/ζ,產(chǎn)生信號(hào)，激活T淋巴細(xì)胞,有效性,CAR構(gòu)成（3）---- co-stimulator,增殖與存活,加入CD28，產(chǎn)生IL-2等,加入CD137（4-

7、1BB），增強(qiáng)多種能力,CD28是T細(xì)胞表面的一個(gè)蛋白，能夠?yàn)門細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，對(duì)T細(xì)胞的活化和存活具有重要作用。T細(xì)胞刺激信號(hào)通過CD28，能夠促進(jìn)多種白介素的分泌。,CD137，又被稱作4-1BB、TNFRSF9等，它是TNF受體家族成員。CD137表達(dá)于活化后的T細(xì)胞，也表達(dá)于樹突細(xì)胞，濾泡樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞以及炎癥位置的血管壁細(xì)胞等。 CD137可以作為共刺激信號(hào)激活T細(xì)胞，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖、

8、存活能力、細(xì)胞裂解作用以及IL-2分泌等。,CAR-T細(xì)胞的發(fā)展過程,第一代CAR-T細(xì)胞發(fā)表時(shí)間：1989年；嵌合受體的形成方法： Eshhar研究小組將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復(fù)合物(ζ鏈)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合形成嵌合受體；激活方式：表達(dá)CAR的T細(xì)胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原, 啟動(dòng)并活化特異性殺傷腫瘤反應(yīng)；CARs表達(dá)的穩(wěn)定性依賴于所用的胞內(nèi)信號(hào)域；大多數(shù)試驗(yàn)在細(xì)胞擴(kuò)增、體內(nèi)存活時(shí)

9、間、細(xì)胞因子分泌等方面存在不足，治療效果不明顯。,CAR-T細(xì)胞的發(fā)展過程,第二代CAR-T細(xì)胞發(fā)表時(shí)間：2010年；嵌合受體的形成方法：T細(xì)胞的完全活化有賴于雙信號(hào)*和細(xì)胞因子的作用。因此，依照T細(xì)胞活化的雙信號(hào)學(xué)說, 第二和第三代CARs 在嵌合受體上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)，以提高T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、增殖活性, 維持T細(xì)胞

10、應(yīng)答, 延長(zhǎng)T細(xì)胞存活時(shí)間等（圖2）； CD28、CD134對(duì)提高初始T細(xì)胞獲得持久的體外增殖和較強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌非常重要 ；在治療慢淋中觀察到：體內(nèi)擴(kuò)增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的時(shí)間也超過6個(gè)月, 分泌的細(xì)胞因子如干擾素-γ、CXCL9等較治療前顯著增高。,T細(xì)胞激活需要雙信號(hào),第一信號(hào)為特異性信號(hào), 由TCR識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物所啟動(dòng); 第二信號(hào)為協(xié)同刺激信號(hào), 通過CD28/B7等重要的共

11、刺激分子, 促進(jìn)IL-2合成, 并使T細(xì)胞充分活化及免于凋亡。,CAR-T細(xì)胞的發(fā)展過程,第三代CAR-T細(xì)胞發(fā)表時(shí)間：2012年；嵌合受體的形成方法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體構(gòu)建第三代CAR-T細(xì)胞(scFv CD20-CD28-CD137-CD3ζ）；兩個(gè)共刺激因子，進(jìn)一步提高細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞毒性患者輸注后4小時(shí)血液就檢測(cè)出有高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子；效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)存活的時(shí)間超過12個(gè)月

12、；由于目前第三代CAR-T細(xì)胞臨床應(yīng)用還比較少, 故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代CAR-T細(xì)胞, 以及選擇怎樣的共刺激分子組合, 還需進(jìn)一步觀察。,2nd & 3rd generation CAR結(jié)構(gòu)示意圖,CAR-T細(xì)胞的發(fā)展過程,第四代CAR-T細(xì)胞（展望）整合自殺基因，精確調(diào)控，細(xì)胞因子釋放（如IL-12）激活等第五代CAR-T細(xì)胞（展望）通用CAR-TCAR-T高度個(gè)性化不便于cGMP管理成本

13、非常高,CAR-T技術(shù)中TAA概念,TAA（ Tumor-Associated Antigen，腫瘤相關(guān)抗原）： 即腫瘤所表達(dá)的抗原，是scFV的結(jié)合抗原，對(duì)CAR-T起定向作用。Perfect TAA：1. 僅存在于腫瘤表面，不在任何正常組織中表達(dá)；2. 為腫瘤生長(zhǎng)所必需，能產(chǎn)生強(qiáng)大的效力；3. 不能通過免疫編輯和腫瘤逃逸而逃脫。TAA基本要求：1. 抗原必須表達(dá)在細(xì)胞表面；2. 腫瘤之外的抗原表達(dá)絕

14、對(duì)不能在重要臟器或者細(xì)胞類型上（例如造血干細(xì)胞）；3. 為了防止抗原逃逸，所有的腫瘤細(xì)胞都必須表達(dá)這個(gè)抗原，換句話說，抗原對(duì)于腫瘤維持其腫瘤特性來說是必需的。,CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢(shì)（1）,CAR-T細(xì)胞治療采用的是患者自體來源的細(xì)胞回輸技術(shù)，避免了移植物抗宿主病等疾病。近年來，美國多項(xiàng)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，惡性腫瘤的CAR-T細(xì)胞治療是一項(xiàng)安全有效的生物治療技術(shù)。針對(duì)CAR-T細(xì)胞所用載體長(zhǎng)達(dá)192人·年的安全性觀測(cè)

15、結(jié)果顯示，載體是非常安全的。 未名CAR-T技術(shù)全程處于GMP標(biāo)準(zhǔn)潔凈車間，嚴(yán)格質(zhì)量控制，全流程檢查，全部合格后才放行，安全性絕對(duì)可靠。,安全性高,CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢(shì)（2）,CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的精髓就是為T細(xì)胞裝上“精確導(dǎo)航系統(tǒng)”，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向“定點(diǎn)清除”，成功避免了對(duì)正常組織和細(xì)胞的傷害。這個(gè)“精確導(dǎo)航系統(tǒng)”就是位于嵌合抗原受體上的scFv片段，它能準(zhǔn)確識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原，然后激活C

16、AR-T細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。,靶向性強(qiáng),CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢(shì)（3）,CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)，除了靶向性強(qiáng)之外，還實(shí)現(xiàn)了T細(xì)胞體內(nèi)增殖以及長(zhǎng)時(shí)期存活，并能形成中樞記憶T細(xì)胞。嵌合抗原受體中包含的腫瘤相關(guān)抗原單鏈抗體、細(xì)胞激活信號(hào)以及共刺激信號(hào)，為T細(xì)胞精準(zhǔn)有效的殺傷作用提供了強(qiáng)有力的支持。目前對(duì)某些類型腫瘤的治愈率（CR）超過60%，部分類型的腫瘤治愈率（CR）甚至超過90%。,臨床效果好,CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的五大優(yōu)

17、勢(shì)（4）,副作用小,CAR-T細(xì)胞整個(gè)治療全程，只需抽血與回輸即可，幾乎無創(chuàng)，對(duì)患者正常生活的影響很小。CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的精確殺傷，極大地避免了對(duì)身體正常組織和細(xì)胞的損害。CAR-T細(xì)胞治療的臨床副作用很少，主要為CAR-T回輸之后，可能會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)的低燒、乏力等癥狀，完全可控。,CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢(shì)（5）,適用范圍廣,CAR-T細(xì)胞療法的治療過程CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)和治療主要有以下幾個(gè)步驟：（1）白細(xì)胞分離：

18、將病人的T細(xì)胞從外周血中分離出來；（2）T細(xì)胞活化：使用抗體包被的磁珠（人工樹突狀細(xì)胞）來激活T細(xì)胞；（3）轉(zhuǎn)染：在體外對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其表達(dá)嵌合抗原受體；（4）擴(kuò)增：基因修飾過的T細(xì)胞在體外擴(kuò)增；（5）化療：在T細(xì)胞回輸之前對(duì)病人進(jìn)行化療預(yù)處理；（6）回輸：將基因修飾過的T細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)（圖2）。,CAR-T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法,基因?qū)氲妮d體主要分為病毒類和非病毒類;病毒載體的轉(zhuǎn)移效率高, 培養(yǎng)T細(xì)胞到達(dá)臨床數(shù)量

19、的時(shí)間相對(duì)較短, 且不同病毒載體具有不同表達(dá)特點(diǎn)，故在基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，是目前主要的基因治療載體。約70%的治療方案采用病毒載體。目前最常用的主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體等；非病毒載體有裸DNA、脂質(zhì)體、多聚物分子耦聯(lián)體等；近年來,，微環(huán)DNA被認(rèn)為是最好的非病毒載體之一, 在基因治療中已被廣為應(yīng)用。,CAR-T細(xì)胞臨床應(yīng)用中的問題,CAR-T細(xì)胞的脫靶效應(yīng)(OFF-TARGET EFFECT)是細(xì)胞對(duì)設(shè)計(jì)

20、之外的額外靶點(diǎn)的作用，導(dǎo)致針對(duì)正常組織的自身免疫病反應(yīng)。原因：除了前列腺特異性膜抗原（PSMA），表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ（EGFRvⅢ等腫瘤特異性抗原外，大多數(shù)靶點(diǎn)是針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原。這些抗原只是重要組織不表達(dá)或是損耗組織表達(dá)。CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子風(fēng)暴（CYTOKINE STORM）體液中多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象，是引起

21、急性呼吸窘迫綜合癥和多器官衰竭的重要原因。原因：CAR-T細(xì)胞更強(qiáng)的親和力和信號(hào)傳導(dǎo)功能使其結(jié)合相關(guān)抗原后，能大量釋放細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)。CAR-T細(xì)胞的插入突變（ INSERTION MUTATION)一個(gè)基因的DNA中如果插入一段外源DNA片段，那么其結(jié)構(gòu)便被破壞而導(dǎo)致突變，稱為插入突變。原因：CAR-T技術(shù)是在T細(xì)胞中插入一段外源DNA片段，理論上說其結(jié)構(gòu)已被破壞，存在一定的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。,CAR-T細(xì)胞存在問題的可能解

22、決辦法,首先, 很多臨床試驗(yàn)采用了劑量爬坡的治療方法。在同一代次的治療中, 把細(xì)胞劑量由小到大分散到幾次回輸中, 并不斷監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒性; 或是應(yīng)用第一或者第二代CAR沒有觀察到毒性后, 再開始下一代CAR-T細(xì)胞的治療, 防止可能誘發(fā)大規(guī)模不良反應(yīng)。其次, 可以引入自殺基因的人工調(diào)控開關(guān), 通過自殺基因系統(tǒng)刪除識(shí)別靶抗原的剩余CAR-T細(xì)胞。第三, 可以把CAR中信號(hào)結(jié)構(gòu)域分裂到兩個(gè)不同CAR(信號(hào)一CAR和信號(hào)二CAR), 只有當(dāng)兩

23、個(gè)CAR與腫瘤表面的靶抗原都結(jié)合以后, 才能完全激活應(yīng)答。第四, 除了激活受體外, 還可以引入抑制性CAR。最后, 還可以根據(jù)靶抗原表達(dá)水平, 微調(diào)CAR親和性。,小結(jié)：目前來看，CAR-T細(xì)胞療法在血液癌的治療中已經(jīng)取得驚人的效果，尤其是針對(duì)B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者的初期緩解率可以達(dá)到90%左右。但是取得顯著療效的CAR-T主要還是集中為靶向CD19的產(chǎn)品，CD19是僅僅表達(dá)在B細(xì)胞表面的特異性抗原，利用CAR-T與CD1

24、9抗原結(jié)合，從而消除B細(xì)胞。通常只能在血液惡性腫瘤（白血病、淋巴瘤等）中起到良好的治療效果。因此，CAR-T研發(fā)要取得長(zhǎng)遠(yuǎn)的成功必須解決兩個(gè)問題：尋找CD19之外的可以與CAR-T有高度親和力的抗原靶標(biāo)，以及將CAR-T的適應(yīng)癥從血液腫瘤逐步轉(zhuǎn)向?qū)嶓w瘤這個(gè)更大的治療市場(chǎng)。研究人員也在積極設(shè)計(jì)開發(fā)新型的CAR-T療法，期望在其他血液腫瘤以及實(shí)體瘤種發(fā)揮類似療效。尋找CD19以外的新型的有潛力的抗原靶標(biāo)，減少毒副反應(yīng)，克服腫瘤微環(huán)境中的免