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文檔簡介
1、嵌合性抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T淋巴細(xì)胞(CAR-T)是通過將外源性人工設(shè)計(jì)的CAR基因?qū)隩淋巴細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因修飾改造,而后得到的表達(dá)CAR的特異性T細(xì)胞。CAR主要由可特異性識別腫瘤抗原的膜外片段,連接片段,和含刺激信號的膜內(nèi)片段組成。膜外片段主要是由靶向抗原分子的單鏈抗體(Single-chain variable fragment,scFv)組成,膜內(nèi)效應(yīng)分子則是由共刺激分子和CD3
2、ζ等T細(xì)胞活化基團(tuán)組成。主要的共刺激分子有CD28,CD27和CD137(4-1BB)等。細(xì)胞外scFv與抗原結(jié)合后可以啟動胞內(nèi)段信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并活化T淋巴細(xì)胞,最終活化的T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷。CAR-T細(xì)胞療法是通過對來源于患者自身的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因修飾而后將自體性CAR-T細(xì)胞回輸給病人治療腫瘤的方法,這是一種最前沿進(jìn)展的腫瘤免疫治療方法。
前期的臨床研究已經(jīng)顯示,特異性靶向CD19分子的CAR-T細(xì)胞能有效地治療B細(xì)
3、胞性惡性腫瘤(表達(dá)有CD19分子),包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL),慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL),和B細(xì)胞淋巴瘤。目前的數(shù)據(jù)表明其對晚期復(fù)發(fā)難治性ALL的治療有效率可達(dá)到80%以上,對CLL和部分B細(xì)胞淋巴瘤的有效率>50%,相關(guān)成果已多次在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志等頂級期刊發(fā)表。CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)成為血液系統(tǒng)腫瘤治療的一個(gè)突破性進(jìn)展。前期CAR-T在實(shí)體瘤的應(yīng)用較少,且療效并無其在血液腫瘤明顯,病人腫瘤緩解率低。去年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志再次
4、報(bào)道了該療法在實(shí)體瘤的重大突破,廣泛顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人在CAR-T細(xì)胞多次回輸后達(dá)到了完全緩解(Complete remission,CR),該結(jié)果極大肯定和明確了CAR-T療法在實(shí)體瘤的應(yīng)用價(jià)值。所以,開展CAR-T療法在實(shí)體瘤的應(yīng)用是十分必要的。
癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen,CEA)是經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物,特別在結(jié)直腸癌病人中有80%以上陽性表達(dá)。正常組織細(xì)胞中只有消化道細(xì)胞有少量的C
5、EA在細(xì)胞膜表達(dá),而該CEA在生理?xiàng)l件下朝向胞腔內(nèi)表達(dá)從而避免被靶向CEA的CAR-T細(xì)胞識別。所以CEA是CAR-T治療結(jié)直腸癌理想的靶點(diǎn)。針對CEA設(shè)計(jì)的CAR-T在國外已經(jīng)完成了動物實(shí)驗(yàn)以及Ⅰ期臨床試驗(yàn),現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床結(jié)果都是在國外獲得,且目前大多處于臨床Ⅰ期階段,病例總數(shù)尚不多;而且在不同的治療機(jī)構(gòu)以及病人個(gè)體間,治療的輸注細(xì)胞數(shù)量都不等,其標(biāo)準(zhǔn)在不同的個(gè)體之間尚需進(jìn)一步探索;更重要的是,我國的腫瘤在發(fā)病率
6、,腫瘤類型,和死亡率等方面都和西方國家不盡相同,目前我們國內(nèi)還沒有開展CAR-T療法在實(shí)體腫瘤應(yīng)用。因此,在我們國家開展CAR-T對腫瘤的臨床治療研究是非常必要的。
我們開展了CAR-T靶向CEA的臨床研究,而在臨床實(shí)踐中也因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞的不足而通過基礎(chǔ)研究來探究功能更強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞。所以,我們的工作主要由臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究兩部分組成:
第一部分、CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的臨床研究證實(shí)了其治療CE
7、A陽性結(jié)直腸癌的安全性和有效性:
為了開展靶向CEA的Ⅰ期CAR-T臨床試驗(yàn),我們前期完成了靶向CEA的CAR-T細(xì)胞的制備,也在體外和動物體內(nèi)驗(yàn)證了其有效性和安全性。我們在國際臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)(clinicaltrial.gov)完成了注冊(編號:NCT02349724),同時(shí)也通過了第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。CEA在結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤中都有廣泛的表達(dá),尤其在結(jié)直腸癌病人中CEA陽性率超過80%。在前期
8、的試驗(yàn)過程中,我們將重心聚焦在結(jié)直腸癌病人的收治上。我們?nèi)虢M了符合納排標(biāo)準(zhǔn)的10例難治復(fù)發(fā)性CEA陽性的結(jié)直腸癌病人,這10例病人全部伴有腸外器官轉(zhuǎn)移(部分病人原發(fā)灶已切除),其中絕大部分為肝轉(zhuǎn)移(7例)。通過采集病人外周血并在GMP實(shí)驗(yàn)室獲得T淋巴細(xì)胞,通過包含CAR序列的慢病毒(lentivirus)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞獲得CAR-T細(xì)胞。在細(xì)胞回輸前,我們使用了淋巴清除(lymphodepletion)的化療方案(氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺,F(xiàn)C)
9、對患者外周血的淋巴細(xì)胞進(jìn)行清除,為CAR-T細(xì)胞的注入提供良好環(huán)境,提高CAR-T治療的療效。大劑量CAR-T細(xì)胞的回輸治療實(shí)體瘤可能存在致死風(fēng)險(xiǎn),為了確保治療的安全性,我們采用了爬坡階梯的輸注模式,在確認(rèn)低劑量細(xì)胞回輸?shù)陌踩院螅賹罄m(xù)病人使用高劑量細(xì)胞回輸。
通過試驗(yàn),我們驗(yàn)證了CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的安全性。在10例病人中,治療劑量從107至1010逐步增加,最高細(xì)胞回輸劑量達(dá)到了5x1010,所有病人均無嚴(yán)
10、重不良反應(yīng)發(fā)生(除FC化療對三系的影響),大部分病人僅報(bào)告少量1-2級不良事件。7例在前期化療療效評價(jià)為疾病進(jìn)展(Progressive disease,PD)的病人在接受CAR-T治療后腫瘤病灶大小保持穩(wěn)定,評價(jià)為病情穩(wěn)定(Stable disease,SD),部分病人維持SD的時(shí)間超過了30周。雖然沒有達(dá)到部分緩解(Partial remission,PR)的診斷標(biāo)準(zhǔn),但有兩例接受高劑量細(xì)胞回輸?shù)牟∪嗽谟跋駥W(xué)可見腫瘤有縮小。另外,大
11、部分病人的血清CEA在治療后明顯下降,提示了CAR-T細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的抑制及殺傷作用。CAR-T細(xì)胞在外周血和體內(nèi)的存續(xù)以及其在體內(nèi)的增殖一直是CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的一個(gè)短板。在我們的臨床試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)接受高劑量細(xì)胞回輸?shù)牟∪薈AR-T細(xì)胞可以在體內(nèi)存活一定時(shí)間,甚至發(fā)現(xiàn)了CAR-T細(xì)胞在外周血的少量擴(kuò)增。總而言之,我們課題組在國內(nèi)首個(gè)報(bào)道了CAR-T在實(shí)體腫瘤應(yīng)用。通過入組10例符合倫理納排標(biāo)準(zhǔn)的晚期結(jié)直腸癌病人,結(jié)
12、合爬坡劑量的回輸模式,我們確認(rèn)了靶向CEA的CAR-T細(xì)胞在治療復(fù)發(fā)難治性結(jié)直腸癌的安全性。考慮到入組的病人均為臨床一線二線化療無效的難治性腫瘤,通過CAR-T治療后,大部分病人(7例/10例)的腫瘤得到了控制,一些病人的腫瘤病灶甚至在影像學(xué)上可以看到縮小。另外,CAR-T細(xì)胞的存活與擴(kuò)增也在我們的試驗(yàn)得到了驗(yàn)證。本臨床試驗(yàn)證明了CAR-T治療實(shí)體瘤的安全性以及其功能,為后續(xù)CAR-T的細(xì)胞優(yōu)化及臨床應(yīng)用提供了良好依據(jù)。
第二
13、部分、CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究通過篩選和對比,我們找到了CAR-T最適、功能最佳的單鏈抗體scFv
在靶向CEA陽性腫瘤的CAR-T臨床試驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)了目前CAR-T細(xì)胞所需要優(yōu)化和改良的地方。CAR-T可以控制和抑制實(shí)體腫瘤的生長,但未能完成對腫瘤的清除,這提示我們需要功能更強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞。目前CAR-T細(xì)胞聯(lián)用PD-1,趨化因子受體(Cxc chemokine receptor,CXCR)均已被證實(shí)
14、可以提高CAR-T細(xì)胞療效。CAR自身結(jié)構(gòu)中的scFv和共刺激信號也會對CAR-T細(xì)胞的功能造成不同的影響,不同scFv與共刺激信號會產(chǎn)生不同功能的CAR。前期報(bào)道提示低親和力的scFv相比于高親和力的scFv(兩個(gè)scFv為源于同一個(gè)單抗的不同突變體)甚至表現(xiàn)出對CEA陽性腫瘤更好的殺傷以及對CEA陰性或弱陽性細(xì)胞更好的安全性。而在不同雜交瘤來源的scFv(靶向不同表位)之間對比發(fā)現(xiàn),高親和力利于提高CAR-T的功能。所以,scFv的
15、親和力與CAR-T細(xì)胞功能是否呈正相關(guān)尚無定論。另外,在培養(yǎng)病人的CAR-T細(xì)胞過程中,我們也發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞表面的CAR表達(dá)陽性率CAR+%在培養(yǎng)過程中呈逐漸下降的趨勢,部分病人的CAR+%在細(xì)胞回輸前降至20%以下,個(gè)別病人甚至因?yàn)榈陀?0%的CAR+%而取消細(xì)胞回輸。我們檢測了靶向HER2和CD19的CAR-T細(xì)胞(僅僅替換了CEA CAR結(jié)構(gòu)的scFv)的CAR變化,上述兩種CAR-T細(xì)胞的CAR+%在培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定。因此
16、,我們推測CEA CAR-T的CAR+%下降的原因可能與scFv有關(guān)。因此,為探究scFv與CAR+%下降的問題并篩選功能最佳的scFv,我們篩選了幾種已知的CEA單抗。我們用于CEA CAR-T的scFv序列是從靶向CEA的單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb) BW431/26中獲得,同時(shí)我們也找到了其他在目前廣泛應(yīng)用的CEA單克隆抗體M5A,hMN-14和C2-45。我們找到上述四種單抗的序列并構(gòu)建出相應(yīng)的s
17、cFv,通過真核細(xì)胞表達(dá)和蛋白純化得到4種scFv蛋白,我們檢測了4種scFv的親和力,發(fā)現(xiàn)M5A和hMN-14的親和力最高,而BW431/26的親和力最低。同時(shí),我們把各scFv的序列裝載到相同的3代CAR骨架并構(gòu)建出對應(yīng)的病毒且完成了對T細(xì)胞的感染,獲得了相應(yīng)的CAR-T。通過比較4個(gè)CAR的CAR+%,我們發(fā)現(xiàn)M5A和hMN-14的CAR-T細(xì)胞的CAR+%在培養(yǎng)過程中可以穩(wěn)定表達(dá),而BW431/26的CAR+%仍呈下降趨勢,C2
18、-45的CAR+%則持續(xù)檢測不到。為了驗(yàn)證CAR-T表面的CAR功能,我們用重組CEA蛋白刺激各CAR-T后檢測凋亡和表面凋亡分子(Tim-3)發(fā)現(xiàn)M5A,hMN-14和BW431/26 CAR-T的相應(yīng)指標(biāo)有明顯升高,提示上述CAR-T對CEA刺激的反應(yīng),這也證明了上述CAR-T細(xì)胞表面的CAR是有功能的。另外,我們也通過細(xì)胞殺傷試驗(yàn)比較了各CAR-T細(xì)胞的功能,發(fā)現(xiàn)M5ACAR-T對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的體外殺傷效果優(yōu)于hMN-14和
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