car-t基礎(chǔ)知識 ppt課件

1、CAR-T基礎(chǔ)知識,向莉偉 CAR-T細胞部2017.07.27,導言：CAR-T（嵌合抗原受體T細胞）藥物是一種有生命的藥物，原理在于經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T細胞，可以特異性地識別腫瘤相關(guān)抗原，使效應(yīng)T細胞的靶向性、殺傷活性和持久性均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細胞高，從而發(fā)揮抗癌作用。CAR-T細胞療法在早期的臨床試驗中并沒有表現(xiàn)出驚人的療效，然而隨著抗CD19 CAR-T細胞療法在B細胞惡性腫瘤中顯示出的巨大潛力，CAR-T產(chǎn)品一時

2、間成了抗腫瘤領(lǐng)域的新星。,什么是CAR-T細胞,嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）T細胞技術(shù)；是過繼細胞免疫治療（adoptive cellular immunotherapy，ACI)的一種；通過基因改造技術(shù)，讓患者T細胞表達嵌合抗原受體，使效應(yīng)T細胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)；是一種特異性的免疫細胞抗腫瘤治療

3、。,T淋巴細胞是腫瘤細胞的天敵，在腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用，對腫瘤細胞有極強的殺傷作用。對T細胞進行基因工程處理，從而在其表面表達能夠識別特異性腫瘤抗原的特殊受體稱為嵌合抗原受體（CAR），同時在受體的胞內(nèi)段可加上引起T細胞活化的信號傳遞區(qū)域。腫瘤對患者的免疫系統(tǒng)具有抑制作用，限制了自身免疫功能的誘導和激活，因此可以把患者的免疫細胞放到一種可以避開腫瘤抑制因素的環(huán)境中進行激活和擴增，然后再將擴增后的免疫細胞回輸患者，從而使患者的

4、免疫功能迅速增強，達到殺傷腫瘤細胞的作用，這種療法就是過繼性免疫療法,CAR-T技術(shù)原理：嵌合抗原受體（CARs）是由一個胞外抗原識別域（通常是一個單鏈抗體，也可以是多肽或者其他蛋白質(zhì)）和一個胞內(nèi)信號域組成。CAR的胞外部分用來識別特異性的腫瘤抗原，隨后胞內(nèi)信號域會刺激T細胞增殖，并且通過細胞溶解和細胞因子釋放來消除腫瘤細胞。,第一代CARs的胞內(nèi)信號域是CD3ζ信號鏈（signal 1），這一代產(chǎn)品在臨床試驗中效果有限，可能由于移

5、植T細胞的活化誘導細胞死亡（AICD）或者T細胞擴增的持續(xù)性不好所導致。第二代CARs相比第一代CARs增加了一個胞內(nèi)共刺激信號域（signal 2）。在過去的5年里，對于第二代含有CD28或者4-1BB(CD137) 共刺激信號域的抗CD19 CAR-T，在治療B淋巴細胞白血病的臨床試驗中都表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，但是仍然需要尋找更好的共刺激信號分子，來解決第二代CAR-T產(chǎn)品作用不持久等問題。第三代CARs不僅包含CD3ζ信號域，還包

6、括兩個共刺激信號分子（圖1），這些共刺激信號分子主要包括CD28、4 -1BB以及OX40 (CD134)等，在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)第三代CAR-T細胞療法效果要優(yōu)于第二代產(chǎn)品,CAR構(gòu)成（1）----scFV（單鏈抗體）,識別腫瘤表面抗原,特異性,CAR構(gòu)成（2）----TCR/CD3/ζ,產(chǎn)生信號，激活T淋巴細胞,有效性,CAR構(gòu)成（3）---- co-stimulator,增殖與存活,加入CD28，產(chǎn)生IL-2等,加入CD137（4-

7、1BB），增強多種能力,CD28是T細胞表面的一個蛋白，能夠為T細胞提供共刺激信號，對T細胞的活化和存活具有重要作用。T細胞刺激信號通過CD28，能夠促進多種白介素的分泌。,CD137，又被稱作4-1BB、TNFRSF9等，它是TNF受體家族成員。CD137表達于活化后的T細胞，也表達于樹突細胞，濾泡樹突狀細胞、NK細胞、粒細胞以及炎癥位置的血管壁細胞等。 CD137可以作為共刺激信號激活T細胞，能夠增強T細胞的增殖、

8、存活能力、細胞裂解作用以及IL-2分泌等。,CAR-T細胞的發(fā)展過程,第一代CAR-T細胞發(fā)表時間：1989年；嵌合受體的形成方法： Eshhar研究小組將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復合物(ζ鏈)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合形成嵌合受體；激活方式：表達CAR的T細胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原, 啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應(yīng)；CARs表達的穩(wěn)定性依賴于所用的胞內(nèi)信號域；大多數(shù)試驗在細胞擴增、體內(nèi)存活時

9、間、細胞因子分泌等方面存在不足，治療效果不明顯。,CAR-T細胞的發(fā)展過程,第二代CAR-T細胞發(fā)表時間：2010年；嵌合受體的形成方法：T細胞的完全活化有賴于雙信號*和細胞因子的作用。因此，依照T細胞活化的雙信號學說, 第二和第三代CARs 在嵌合受體上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)，以提高T細胞的細胞毒性、增殖活性, 維持T細胞

10、應(yīng)答, 延長T細胞存活時間等（圖2）； CD28、CD134對提高初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的細胞因子分泌非常重要 ；在治療慢淋中觀察到：體內(nèi)擴增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的時間也超過6個月, 分泌的細胞因子如干擾素-γ、CXCL9等較治療前顯著增高。,T細胞激活需要雙信號,第一信號為特異性信號, 由TCR識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-MHC復合物所啟動; 第二信號為協(xié)同刺激信號, 通過CD28/B7等重要的共

11、刺激分子, 促進IL-2合成, 并使T細胞充分活化及免于凋亡。,CAR-T細胞的發(fā)展過程,第三代CAR-T細胞發(fā)表時間：2012年；嵌合受體的形成方法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體構(gòu)建第三代CAR-T細胞(scFv CD20-CD28-CD137-CD3ζ）；兩個共刺激因子，進一步提高細胞增殖能力及細胞毒性患者輸注后4小時血液就檢測出有高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等細胞因子；效應(yīng)細胞在體內(nèi)存活的時間超過12個月

12、；由于目前第三代CAR-T細胞臨床應(yīng)用還比較少, 故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代CAR-T細胞, 以及選擇怎樣的共刺激分子組合, 還需進一步觀察。,2nd & 3rd generation CAR結(jié)構(gòu)示意圖,CAR-T細胞的發(fā)展過程,第四代CAR-T細胞（展望）整合自殺基因，精確調(diào)控，細胞因子釋放（如IL-12）激活等第五代CAR-T細胞（展望）通用CAR-TCAR-T高度個性化不便于cGMP管理成本

13、非常高,CAR-T技術(shù)中TAA概念,TAA（ Tumor-Associated Antigen，腫瘤相關(guān)抗原）： 即腫瘤所表達的抗原，是scFV的結(jié)合抗原，對CAR-T起定向作用。Perfect TAA：1. 僅存在于腫瘤表面，不在任何正常組織中表達；2. 為腫瘤生長所必需，能產(chǎn)生強大的效力；3. 不能通過免疫編輯和腫瘤逃逸而逃脫。TAA基本要求：1. 抗原必須表達在細胞表面；2. 腫瘤之外的抗原表達絕

14、對不能在重要臟器或者細胞類型上（例如造血干細胞）；3. 為了防止抗原逃逸，所有的腫瘤細胞都必須表達這個抗原，換句話說，抗原對于腫瘤維持其腫瘤特性來說是必需的。,CAR-T細胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢（1）,CAR-T細胞治療采用的是患者自體來源的細胞回輸技術(shù)，避免了移植物抗宿主病等疾病。近年來，美國多項臨床試驗數(shù)據(jù)證實，惡性腫瘤的CAR-T細胞治療是一項安全有效的生物治療技術(shù)。針對CAR-T細胞所用載體長達192人·年的安全性觀測

15、結(jié)果顯示，載體是非常安全的。 未名CAR-T技術(shù)全程處于GMP標準潔凈車間，嚴格質(zhì)量控制，全流程檢查，全部合格后才放行，安全性絕對可靠。,安全性高,CAR-T細胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢（2）,CAR-T細胞治療技術(shù)的精髓就是為T細胞裝上“精確導航系統(tǒng)”，對腫瘤細胞進行靶向“定點清除”，成功避免了對正常組織和細胞的傷害。這個“精確導航系統(tǒng)”就是位于嵌合抗原受體上的scFv片段，它能準確識別腫瘤細胞表面的腫瘤相關(guān)抗原，然后激活C

16、AR-T細胞，對腫瘤細胞進行殺傷。,靶向性強,CAR-T細胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢（3）,CAR-T細胞治療技術(shù)，除了靶向性強之外，還實現(xiàn)了T細胞體內(nèi)增殖以及長時期存活，并能形成中樞記憶T細胞。嵌合抗原受體中包含的腫瘤相關(guān)抗原單鏈抗體、細胞激活信號以及共刺激信號，為T細胞精準有效的殺傷作用提供了強有力的支持。目前對某些類型腫瘤的治愈率（CR）超過60%，部分類型的腫瘤治愈率（CR）甚至超過90%。,臨床效果好,CAR-T細胞治療技術(shù)的五大優(yōu)

17、勢（4）,副作用小,CAR-T細胞整個治療全程，只需抽血與回輸即可，幾乎無創(chuàng)，對患者正常生活的影響很小。CAR-T細胞對腫瘤細胞的精確殺傷，極大地避免了對身體正常組織和細胞的損害。CAR-T細胞治療的臨床副作用很少，主要為CAR-T回輸之后，可能會出現(xiàn)短時間內(nèi)的低燒、乏力等癥狀，完全可控。,CAR-T細胞治療技術(shù)的五大優(yōu)勢（5）,適用范圍廣,CAR-T細胞療法的治療過程CAR-T細胞的生產(chǎn)和治療主要有以下幾個步驟：（1）白細胞分離：

18、將病人的T細胞從外周血中分離出來；（2）T細胞活化：使用抗體包被的磁珠（人工樹突狀細胞）來激活T細胞；（3）轉(zhuǎn)染：在體外對T細胞進行基因改造，使其表達嵌合抗原受體；（4）擴增：基因修飾過的T細胞在體外擴增；（5）化療：在T細胞回輸之前對病人進行化療預處理；（6）回輸：將基因修飾過的T細胞回輸入病人體內(nèi)（圖2）。,CAR-T細胞基因轉(zhuǎn)導的方法,基因?qū)氲妮d體主要分為病毒類和非病毒類;病毒載體的轉(zhuǎn)移效率高, 培養(yǎng)T細胞到達臨床數(shù)量

19、的時間相對較短, 且不同病毒載體具有不同表達特點，故在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中應(yīng)用廣泛，是目前主要的基因治療載體。約70%的治療方案采用病毒載體。目前最常用的主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體等；非病毒載體有裸DNA、脂質(zhì)體、多聚物分子耦聯(lián)體等；近年來,，微環(huán)DNA被認為是最好的非病毒載體之一, 在基因治療中已被廣為應(yīng)用。,CAR-T細胞臨床應(yīng)用中的問題,CAR-T細胞的脫靶效應(yīng)(OFF-TARGET EFFECT)是細胞對設(shè)計

20、之外的額外靶點的作用，導致針對正常組織的自身免疫病反應(yīng)。原因：除了前列腺特異性膜抗原（PSMA），表皮生長因子受體Ⅲ（EGFRvⅢ等腫瘤特異性抗原外，大多數(shù)靶點是針對腫瘤相關(guān)抗原。這些抗原只是重要組織不表達或是損耗組織表達。CAR-T細胞的細胞因子風暴（CYTOKINE STORM）體液中多種細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象，是引起

21、急性呼吸窘迫綜合癥和多器官衰竭的重要原因。原因：CAR-T細胞更強的親和力和信號傳導功能使其結(jié)合相關(guān)抗原后，能大量釋放細胞因子，引起炎癥反應(yīng)。CAR-T細胞的插入突變（ INSERTION MUTATION)一個基因的DNA中如果插入一段外源DNA片段，那么其結(jié)構(gòu)便被破壞而導致突變，稱為插入突變。原因：CAR-T技術(shù)是在T細胞中插入一段外源DNA片段，理論上說其結(jié)構(gòu)已被破壞，存在一定的致瘤風險。,CAR-T細胞存在問題的可能解

22、決辦法,首先, 很多臨床試驗采用了劑量爬坡的治療方法。在同一代次的治療中, 把細胞劑量由小到大分散到幾次回輸中, 并不斷監(jiān)測細胞毒性; 或是應(yīng)用第一或者第二代CAR沒有觀察到毒性后, 再開始下一代CAR-T細胞的治療, 防止可能誘發(fā)大規(guī)模不良反應(yīng)。其次, 可以引入自殺基因的人工調(diào)控開關(guān), 通過自殺基因系統(tǒng)刪除識別靶抗原的剩余CAR-T細胞。第三, 可以把CAR中信號結(jié)構(gòu)域分裂到兩個不同CAR(信號一CAR和信號二CAR), 只有當兩

23、個CAR與腫瘤表面的靶抗原都結(jié)合以后, 才能完全激活應(yīng)答。第四, 除了激活受體外, 還可以引入抑制性CAR。最后, 還可以根據(jù)靶抗原表達水平, 微調(diào)CAR親和性。,小結(jié)：目前來看，CAR-T細胞療法在血液癌的治療中已經(jīng)取得驚人的效果，尤其是針對B細胞急性淋巴細胞白血病患者的初期緩解率可以達到90%左右。但是取得顯著療效的CAR-T主要還是集中為靶向CD19的產(chǎn)品，CD19是僅僅表達在B細胞表面的特異性抗原，利用CAR-T與CD1

24、9抗原結(jié)合，從而消除B細胞。通常只能在血液惡性腫瘤（白血病、淋巴瘤等）中起到良好的治療效果。因此，CAR-T研發(fā)要取得長遠的成功必須解決兩個問題：尋找CD19之外的可以與CAR-T有高度親和力的抗原靶標，以及將CAR-T的適應(yīng)癥從血液腫瘤逐步轉(zhuǎn)向?qū)嶓w瘤這個更大的治療市場。研究人員也在積極設(shè)計開發(fā)新型的CAR-T療法，期望在其他血液腫瘤以及實體瘤種發(fā)揮類似療效。尋找CD19以外的新型的有潛力的抗原靶標，減少毒副反應(yīng)，克服腫瘤微環(huán)境中的免