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1、綜合性實(shí)驗(yàn)外周血培養(yǎng)及核型分析,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)常用而重要的技術(shù),它涉及的技術(shù)有:無(wú)菌操作技術(shù)、細(xì)胞分離技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、顯微攝影技術(shù)、圖像分析技術(shù)等。 Moorhead和Levan等(1960)建立的人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),以及Rothrels等(1958)建立的氣干法制片技術(shù),成了研究人與哺乳類(lèi)染色體的最主要技術(shù)。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、 掌握無(wú)菌操作的原理和方法;2、 掌握外周血培養(yǎng)的原
2、理和方法;3、 掌握顯微攝影和圖象分析的原理和方法;4、 掌握外周血淋巴細(xì)胞染色體制備的技術(shù);5、 綜合運(yùn)用已掌握的知識(shí)基礎(chǔ)和已具備的 實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?,提高科學(xué)研究的綜合素質(zhì)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生存,必須模擬體內(nèi)環(huán)境,共給細(xì)胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關(guān)的生長(zhǎng)因子;氧氣及適宜的溫度;注意調(diào)節(jié)其外環(huán)境的酸堿度(pH)與
3、滲透壓;以及為排除細(xì)胞代謝產(chǎn)物的危害,保持良好適宜的外環(huán)境而進(jìn)行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無(wú)菌條件下進(jìn)行。,外周血淋巴細(xì)胞是不能增殖的分化細(xì)胞群,在體外無(wú)菌培養(yǎng)條件下,若于培養(yǎng)基中植物凝集素(PHA)則可刺激處于G。期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞,重新有絲分裂的能力,經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)即可獲得大量分裂期細(xì)胞以供染色體分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通過(guò)干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成,使細(xì)胞分裂順利進(jìn)入后期而停滯于中期,從而可
4、在短期內(nèi)積累大量最適于進(jìn)行染色體分中期分裂相。此外,秋水仙素還能使染色單體縮短、分開(kāi),使染色體呈現(xiàn)明顯形狀而利于辨認(rèn)。,染色體標(biāo)本制備過(guò)程中有兩個(gè)重要環(huán)節(jié), 原理如下:(1)低滲處理:目的是使水分通過(guò)細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)滲入,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞,染色體進(jìn)一步分散而利于分析。同時(shí),低滲處理還可使紅細(xì)胞質(zhì)膜破裂,經(jīng)后血影浮于上清中被去除,后續(xù)的固定過(guò)程主要針對(duì)淋巴細(xì)胞,改善了淋巴細(xì)固定質(zhì)量及標(biāo)本質(zhì)量。(2)固定:目的在于盡快使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)固
5、定于接近存活的狀態(tài),以便作進(jìn)一步處理,若不固定則可因細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。染色體研究中常用固定液為甲醇一冰醋酸(3:1)固定液。冰醋酸滲透力強(qiáng),固定迅速,但易使組織膨脹而甲醇則可使組織收縮,兩者混合使用能抵消各自的缺點(diǎn),得到較好的固定效果。,三、實(shí)驗(yàn)用品,(1)器材:冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、無(wú)菌培養(yǎng)瓶、10ml離心管、顯微攝影裝置。(2)試劑:RPMI 1640或Eagles MEM培養(yǎng)液、小牛血清
6、(FCS)、PHA、秋水仙素、O.075M KCl、甲醇、冰醋酸;肝素、Giemsa、pH6.8的PBS。(3)材料:動(dòng)物外周血,四、實(shí)驗(yàn)方法(實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)),(1)采血:用肝素潤(rùn)濕注射針筒(0.2m1)后,常規(guī)取靜脈血約1~2ml,轉(zhuǎn)動(dòng)針筒混勻肝素。(2)接種(在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作):在每個(gè)培養(yǎng)瓶中(含20%血清的1640培養(yǎng)液5ml,pH7.2),加入全血O.25~O.30ml(7號(hào)針頭13~15滴)、PHA 5mg,蓋緊膠塞
7、,輕輕搖勻后。(3)培養(yǎng):將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前2~4 h,加入O·01%秋水仙素溶液(100μg/m1)1~2滴(7號(hào)針頭),使終濃度為0.2μg/ml培養(yǎng)液。輕輕搖勻后,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2~4h。,(4)收獲:將培養(yǎng)后的血細(xì)胞收集在離心管中,平衡后1 000r/min離心8 min,棄去上清。(5)低滲:向離心管中加入37℃ 0.075 mol/L KCl溶液至8ml,用吸管輕輕吹打混
8、勻細(xì)胞,置于37℃水浴箱溫育15 min。(6)預(yù)固定:向離心管中滴加新配制的甲醇一冰醋酸固定液1~2 ml,用吸管輕輕吹打混勻后1000r/min離心8min,棄去上清。(7)固定:加入新配制的固定液至8 ml,室溫靜置30 min。1 000 r/min離心8min,棄去上清??稍僦貜?fù)固定1次。,(8)制片:根據(jù)沉淀細(xì)胞的多少,加入適量新鮮固定液(O.5~lml),輕輕吹打制成細(xì)胞懸液。用滴管吸取少量細(xì)胞懸液,滴至冰冷的載玻片上
9、,立即甩口。吹散,酒精燈火焰過(guò)一下,冷風(fēng)吹干或氣干。(9)染色:1:10 Giemsa染液(pH 6.8)染色10~20 min。流水沖洗,晾干,鏡檢。(10)攝影分析:選好的分裂相進(jìn)行顯微攝影,并用圖象分析軟件進(jìn)行核型分析。,五、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明(注意事項(xiàng)),(1) 無(wú)菌操作是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵,采血時(shí)要注意無(wú)菌操作,試劑配置要進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾,所用培養(yǎng)器械要進(jìn)行滅菌處理。(2) PHA添加很重要,如保存不善,效價(jià)低或數(shù)量不足,則作用差,但
10、濃度過(guò)大,紅細(xì)胞凝塊,這些都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。(3) 秋水仙素用量過(guò)大,染色體過(guò)度收縮,乃至染色單體離散,用量過(guò)小則影響分裂相。(4) 低滲處理極為重要,低滲不夠,則染色體聚在一起,分散不好。太過(guò),則造成細(xì)胞破碎,染色體丟失。,(5) 離心速度太高,細(xì)胞團(tuán)塊不易打散,速度太低,則會(huì)丟失細(xì)胞。(6) 細(xì)胞太多或太少亦能影響分裂相的多少,及標(biāo)本質(zhì)量。(7)機(jī)械打散細(xì)胞團(tuán)時(shí),用力要適度,若用力過(guò)猛,細(xì)胞易破碎,染色體不完整。((8).
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