H3N2亞型豬流感病毒生物學特性和HA、NA、NS基因特性的研究.pdf

1、本實驗對2004年廣東省部分地區(qū)出現(xiàn)呼吸道癥狀的豬群或病死豬的鼻拭子和病變肺臟進行了豬流感病毒(SIV)的分離鑒定。所采病料勻漿滅菌，接種SPF雞胚擴增培養(yǎng)并且傳代，收獲雞胚尿囊液。利用豬流感標準診斷試劑，用血凝和血凝抑制試驗檢測病毒并且鑒定分離毒株病毒亞型為H3亞型SIV。對所分離到的6株H3亞型SIv分離株進行了生物學特性測定，分離毒株紅細胞凝集譜廣泛，血凝素對熱不穩(wěn)定，對雞胚表現(xiàn)較高的致病性，能夠感染小白鼠并表現(xiàn)典型的呼吸道癥狀和

2、眼觀病變。 應用Primer Premier 5.0引物設計分析軟件設計H3N2亞型SIV HA、NA、NS、NSl基因片段的特異性PCR引物。分別從6株H3亞型SIV分離株感染的SPF雞胚尿囊液中直接提取核酸。通過反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法擴增各個毒株的HA、NA、NS基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)分離純化后克隆到pMD 18-T載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定純化后再送測序公司進行序列測定，然后應用DNAStar軟件進行

3、序列的拼接、序列信息編輯和分析。同時從GenBank中下載了H3N2亞型豬流感各時間和地域的代表株，分析6個毒株3個基因片段的核苷酸和氨基酸的序列，以闡明廣東地區(qū)H3N2亞型SIV分離株的基因來源和遺傳衍化規(guī)律。結果6個病毒同源性很高，在HA裂解位點處的氨基酸序列均為PEKQTR*G，不屬于高致病性流感病毒。它們的3個基因與1999年以后香港豬群中流行的流感和2000年以后北美流行的H3N2亞型流感毒株關系密切。 根據(jù)序列分析結

4、果選擇其中一個SIV分離株進行非結構蛋白基因的重組質(zhì)粒pMDl8 T-NS中的NSl基因片段的亞克隆。再將其插入表達載體pET 28a中進行基因重組和大腸桿菌誘導表達。構建出了H3亞型SIV NSl基因的重組表達載體，初步建立了NSl基因在大腸桿菌的表達條件。為NSl基因蛋白的大量誘導表達及其下游工作做好了準備。 總之，本研究系統(tǒng)地闡明了目前廣東地區(qū)H3N2亞型SIV分離株的生物學特性、基因來源、分子遺傳衍化情況和NSl基因的表